【求助】磷酸化蛋白WB结果不是非特异条带就是白板

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】磷酸化蛋白WB结果不是非特异条带就是白板

24 1/3 1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】磷酸化蛋白WB结果不是非特异条带就是白板

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-12-18 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近一直做一种酪氨酸磷酸化蛋白，电泳、转膜基本没有问题，试过5%脱脂奶粉和5%BSA封闭2h，一抗（CST，5%BSA-TBST配，推荐1：1000）做了几个梯度1：1000，1：2000，1：4000，二抗（博奥森，配法同一抗）1：4000，1：5000，洗膜都是10min*4次，ECL显色，压片最长1h，结果如下：
5%脱脂奶粉封闭2h-一抗1：2000，二抗1:4000，-泳道样的非特异性条带，但是目的蛋白大小的条带较浓
5%BSA封闭2h-一抗1：4000，二抗1：5000-白板
5%BSA封闭5h-一抗1：1000和1：2000，二抗，1：5000-几乎是白板，不过能看到泳道样的轮廓
看过真多相关的帖子还是很迷惑啊
请教各位前辈，尤其是有过类似经验的前辈们，怎么样才能得到理想一点的结果呢？我要调整封闭时间还是抗体比例？谢谢！在线等啊

fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态离线

发表于 2013-12-18 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不是有经验的同学，但我觉得你要调抗体浓度，试着把二抗浓度加大点，不要一抗二抗同时稀释，那样你就发现不了是谁浓度的问题了。或者用脱脂奶封闭，二抗用1：5000试试。我一般封闭一个小时就可以的，我用的是脱脂奶，但后来有一个蛋白出的不太好，我也在寻找帮助呢

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-12-18 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！
之前很多人都说用BSA封闭更好，所以我后几次用的都是BSA，不知道你用脱脂奶1h也是磷酸化蛋白吗？二抗1：5000不变，一抗不同梯度都几乎是白板。

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-12-18 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问谁还有好的建议吗？我实在不知道怎么下一步怎么改变条件了
之前帖子上有人说“封闭液封闭时间不宜过长，否则会置换掉膜上的蛋白”，请问这种说法对吗？

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-12-18 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用牛奶封闭的时候，有出条带，那你应该尝试一下使用牛奶的情况下，分别降低一点一抗和二抗浓度会不会有条带。比如你可以做两次这样的：
1，5%牛奶，一抗1:3000，二抗1:4000
2，5%牛奶，一抗1:2000，二抗1:5000
对于特定的蛋白，用牛奶和用BSA常常会出现不同的结果。

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-12-18 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

之前试过你说的第二种方法，不过当时压了30min白板就没继续延长时间。
今天3%BSA，2h，一抗1：2000,二抗1：5000，结果marker也曝出来了，非特异性条带比目的条带深很多，考虑是不是应该封闭过夜，并且提高一抗浓度才行？

ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态离线

发表于 2013-12-18 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是磷酸化蛋白，脱脂奶封闭1小时。
我觉得你可以继续稀释下二抗的浓度，一抗就用1：2000。如果目的条带不是很浅可以不换一抗浓度。还有就是你做的是组织还是细胞，有时候蛋白提取不好时做的条带也不好，蛋白提取也很重要。如果都没问题，建议你换用一下二抗试试，找其他同学的好的二抗试用一下。

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-12-18 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

结果还是不理想，郁闷ing~
3%BSA 4度过夜，一抗1：2000 4度过夜，TBST10*4，二抗1:5000,RT 30min，TBST10*5，结果还是有maker显色，奇怪的是一张膜上一些目的条带和非特异性条带同时出现，另一些基本什么都没有，不知道什么原因？
难道真的如楼上战友说的蛋白提取有问题？

小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2013-12-18 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前我也做过磷酸化蛋白WB,封闭1小时,没问题的也没杂带.个人觉得上面说的蛋白制样和抗体的问题值得考虑.国内抗体就没国外的好

H2O[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2013-12-18 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

据说磷酸化的蛋白很容易脱磷酸化，所以样品一定要新鲜的，一般是一周以内的。不知是否准确？

24 1/3 1 2 3 ››