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标题:【求助】很离奇的现象，做SDS-PAGE时，加样孔上方出现...

bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-12-18 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】很离奇的现象，做SDS-PAGE时，加样孔上方出现...


同仁们你们好，我现在在做带有组氨酸标签的蛋白质纯化，我的目的蛋白是以包涵体的形式表达的，我用的是6M的盐酸胍作为变性剂，包涵体结合缓冲液缓冲液具体成分如下：6M盐酸胍，500mM NACL，20mM Tris，1mMBME，PH为8.0，变性后高速离心后微膜过滤，上柱，然后用含有500mM的咪唑洗脱缓冲液（其他成分与结合缓冲液相同）洗脱，分别取样包括上样液，穿出液，洗脱液，分别取40u样品与5Xloading buffer混匀煮沸5分钟离心后上样，一小会以后发现在加样孔上方漂浮出絮状的东西，我的电泳是恒压浓缩胶140V，分离胶180V，Marker电泳正常，但是样品孔里面的样品有任何动的痕迹，当Marker快跑到最下方的时候，才看到样品孔的溴酚蓝才开始移动，等其跑到最下方后染色后发现样品泳道没有任何条带！！！请高手明鉴絮状的东西是我的蛋白质吗？为什么会加进孔里面后会变成絮状飘起来？跟我的缓冲液有关系吗？之前我用的8M尿素缓冲液的时候没出现这种情况，有没有方法可以改正？我连电泳都跑不上，就没法看那个成分里有我的目的蛋白啊！谢谢啦！
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发表于 2013-12-18 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 bamboo16 的帖子

可能是变性的蛋白在电泳缓冲液中复性了，但复性不正确，就沉淀出来了。但是loading buffer中有SDS和DTT，煮过后什么蛋白都变性了，不应该会再复性啊
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发表于 2013-12-18 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
盐酸胍的原因，盐酸胍变性蛋白不能直接做SDS-PAGE电泳，你用尿素和 Sarkosyl就可以~
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发表于 2013-12-18 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
貌似你的上样缓冲液有问题。
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发表于 2013-12-18 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"加样孔上方漂浮出絮状的东西" ,貌似你的上样缓冲液有问题。
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发表于 2013-12-18 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 plaa 于 2013-12-18 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
貌似你的上样缓冲液有问题。

可是我的Marker没问题啊，之前跑得一般的样品也没问题啊。我的缓冲液应该没问题的啊、
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 小中大


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原帖由 plaa 于 2013-12-18 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
盐酸胍的原因，盐酸胍变性蛋白不能直接做SDS-PAGE电泳，你用尿素和 Sarkosyl就可以~

为什么盐酸胍变形样品不能直接上样啊，什么原理啊，如果我要做检测，样品要怎么处理才能上样啊？请高手指点。
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发表于 2013-12-18 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 2541 于 2013-12-18 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可能是变性的蛋白在电泳缓冲液中复性了，但复性不正确，就沉淀出来了。但是loading buffer中有SDS和DTT，煮过后什么蛋白都变性了，不应该会再复性啊

我的一个老师也是这样说的，可能是复性不正确。我想的跟你想得一样，都煮沸了的样品不可能再复性了。
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发表于 2013-12-18 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

盐酸胍和SDS生成沉淀。所以不能直接上样。
你可以自己用sds溶液和盐酸胍溶解混合看看就知道了。
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bamboo16[使用道具]
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 小中大


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原帖由 plaa 于 2013-12-18 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

盐酸胍和SDS生成沉淀。所以不能直接上样。
你可以自己用sds溶液和盐酸胍溶解混合看看就知道了。

真是太感谢了。所以只要我再上样缓冲液中不加SDS就应该可以上样了是吧。
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