拉曼光譜學及其在生化上的應用

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标题:拉曼光譜學及其在生化上的應用

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拉曼光谱學及其在生化上的應用

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　　以波動觀點來看，光是一種電磁波，由互相垂直的電場向量E與磁場向量H組成，而E與H又都垂直於光行進的方向，如圖一所示。當光波的電場與物質交互作用時，光可能被吸收或散射。

　　對於吸收光譜學(absorption spectroscopy)有些人可能已相當熟悉，例如紫外光譜學(UV)和紅外光譜學(IR)皆是(參閱本刊70-9月號林敬二著「紅外線光譜簡介」一文)。本文僅將紫外光譜與紅外光譜簡單的原理表示於圖二與圖三。

　　光的散射

　　拉曼(Raman)光譜是導源於光的散射而造成的。當入射光被偏折後便造成散射，這是因為入射光的電磁波的電場向量與物質本身的電子交互作用而導致光的散射。此交互作用引起電子的週期性振動，隨伴產生振盪電矩(electric moment)，振盪的電子為放射輻射新的來源，即散射光的來源。

　　散射現象可分為三種：一﹑彈性散射，其頻率與入射光相等，稱為瑞來(Rayleigh)散射;二﹑低頻率的非彈性散射，其散射頻率低於入射光，稱為史托克拉曼(Stokes Raman)散射;三﹑高頻率的非彈性散射，其散射頻率高於入射光，稱為反-史托克拉曼(anti-Stokes Raman)散射。

　　對人類而言，瑞來散射是最為熟悉的，我們之所以能看見各種物體即肇因於光的瑞來散射。由實驗得知散射效率與波長的四次方成反比。太陽光中的藍光波長比紅光短，因此它比紅光更容易散射。我們看晴天天空是藍色的，即因為藍光是陽光在空氣中的主要散射成分。反之在清晨或黃昏時，太陽光必須穿透較厚的大氣層才到達我們眼中，而此時大多數的藍光已被空氣分子所散射，所剩餘的橙紅光線才進入我們眼中。

　　相對於瑞來散射，拉曼散射在我們日常生活中較不易察覺，可是對科學家來說，它對於研究分子振動和轉動十分有用。拉曼散射涉及兩種能量相異的光子，即入射光子與散射光子，此能量差是因為分子與入射光子相互作用，而使分子的振動或轉動狀態改變。也基於此種特性，拉曼光譜成為研究分子振動光譜的利器之一。

　　散射光的強度受到很多因素的影響，其中包括：一﹑被照射的粒子或分子的大小。二﹑觀察散射的位置。散射強度是相對應的入射光角度的函數。三﹑入射光的頻率。四﹑入射光的強度。

　　拉曼散射

　　首先談非共振(nonresonance)拉曼散射(共振拉曼散射後述)。入射光的能量不足以激發分子至更高的電子能階，而僅改變分子的振動狀態，即振動能階的改變(見圖四)。

　　欲使分子呈現拉曼效應，入射光必須使分子產生感應偶極矩(induced dipole moment)或改變分子的偏極化性(polarizability)。以二氧化碳為例，偏極化性的改變可視為電子雲外形的變化。如圖五所示，由於和電磁波的電場向量交互作用，二氧化碳分子交錯的伸縮。具有某種振動模式的電子可以與入射光耦合(couple)，產生改變頻率的散射光。和瑞來散射(頻率與入射光相同)相比，拉曼散射強度通常僅為瑞來散射的10-6，大部分散射光的能量與原先的入射光相同。也基於此因素，雷射常被做為光源，它是高強度的單色光，用以產生許多的散射光子。

　　拉曼散射又區分為史托克譜線與反-史托克譜線。當光子與分子交互作用，它們的一部分能量可被轉換成各種的分子振動模式。如圖四所示，散射光失去的能量相等於給予分子振動的能量(史托克拉曼效應);反之，若能量是由分子轉移給散射光，則散射光比入射光具有更高的能量(反-史托克拉曼效應)。當然此種散射的先決條件是散射分子須事先處於能量稍高的激發狀態。但是因為大多數分子在室溫下是處於基底狀態，所以實際上而言，史托克拉曼散射強於反-史托克拉曼散射。又因為史托克譜線和反-史托克譜線都有相同的振動能量差，因此兩者的散射頻率與入射光頻率之間的差額是一樣的，換言之就是對稱的。由圖六可以看出兩譜線對稱，而史托克譜線較強的情形。

　　圖六中是以入射光15798cm-1(cm-1波數，波數 ν=1/λ波長的倒數)照射二硫化碳(CS2)產生兩個拉曼散射光譜線，分別位於15150cm-1與16450cm-1處。單看以上兩個數值無法看出其意義的相關，然而從散射光與入射光的頻率差額可獲知此頻率差額為分子的特性所在。因此拉曼散射光譜是以波數差來表示的，而非用波數的絕對值。

　　史托克譜線和反-史托克譜線雖具有一樣的頻率差額，但是在一般情況下史托克譜線的強度較高。當分子與入射光(能量為hν0，h為蒲朗克常數)交互作用，若其振動能階由低升高了h△ν(見圖七)，則可產生史托克譜線。另一種情形，若分子原本即處於高振動能階，受到入射光hν0照射後，它可釋出較高的能量光子，此時分子的振動能階降低而散射光多獲得了h△ν的能量。在低溫時，大部分的分子是處於低振動能階狀態，因此大部分的分子呈現出史托克型式的能階轉移。我們可以用波茲曼(Boltzmann)分布定律來解釋。此定律為

　　Ni/No=e-△E/kT

　　Ni：能量處於Ei狀態的分子數。

　　No：能量處於Eo狀態的分子數。

　　k：波茲曼常數。

　　T：絕對溫度。

　　△E：高能狀態 Ei與低能狀態Eo之間的差額。

　　e：自然對數的底。

　　有一點須特別注意的是普通拉曼散射光譜線的位置與入射光的頻率無關，但其散射強度是依於入射光的頻率(散射強度與波長的四次方λ4成反比)。因此不論用綠色光或藍色光去照射一個分子，所得到的拉曼譜線是位於相同的波數差位置，請參閱圖八。

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拉曼光譜法與紅外線光譜法

　　振動時分子的偶極矩(與感應偶極矩不同)發生改變才會產生紅外線吸收光譜;而對一個要呈現拉曼光譜的分子來說，必須感應偶極矩改變才行，也就是分子的偏極化性發生改變。分子的總能量為電子能量、振動能量、轉動能量和移動能量四者的總和。拉曼光譜與紅外光譜主要是與分子的振動能量相關。由於拉曼光譜與紅外光譜有互補之關係，因此如果想得知分子全部的振動模式，則必須檢視此兩種光譜。

　　拉曼光譜與紅外光譜固然有少數相似之處，然而基本上卻完全相異的。請看圖九的振動能階圖，無論在拉曼散射過程或紅外光吸收中，一個分子淨得的能量是相等的，但過程不同。以甲苯的兩種光譜為例(見圖十)，有些波數之處既有拉曼譜線又有紅外光譜線(但強度可能不同)，但有些地方僅出現一種光譜之譜線。

　　拉曼光譜與紅外光譜的基本原理相異，也就是二者的選擇規律(selection rules)不相同。當分子本身具有對稱中心時，在相同波數之位置不會同時有拉曼散射譜線與紅外光吸收譜線之出現。此處所稱之對稱中心是指從分子中的一個原子畫一直線通過分子中心點後，在另一邊等距離的位置可遇上相同元素的另一個原子。例如：二氧化碳、苯(其光譜見圖十一)、(pyrazine)與反式 -1,2-二氯乙烯(見圖十二)，在這些分子中，如果某一譜線的波數(亦即頻率)是源於基本振動，則在此波數位置不會同時有拉曼與紅外光譜線呈現。此稱之為「相互不共容規則」(mutual exclusion rule)。

　　共振拉曼散射

　　以頻率能激發電子至激發狀態的入射光去激發一個化合物，此時部分的拉曼譜線強度會加強，這是分子能階的電子轉移與振動轉移耦合的結果，稱為共振拉曼散射。如果入射光的能量只是接近而不高於分子的電子激發能階，則另稱為共振前拉曼散射。至於通常的非共振拉曼散射，其虛態(virtual state)的能階遠低於電子轉移的能階，請參閱圖十三。虛態是指當分子與光交互作用時，分子的能階暫時升至較高而不穩定的能量狀態而言。

　　簡單分子的振動模式

　　首先以三原子彎曲形的水分子H2O為例，它有三種基本振動模式(見圖十四)，分別為ν1、ν2及ν3。與此三種模式相應的偏極化性橢圓體也表示於圖十四中。在ν1對稱伸縮中，如果化學鍵伸長，則原子核對電子的拉力減弱，此時化學鍵易被偏極化(α大，即1/√α小，而 1/√α代表橢圓體的軸)。所以當化學鍵伸長時，水分子的偏極化性橢圓體變小;反之當化學鍵收縮時則變大。如果水分子是以ν2模式做彎曲運動，此時橢圓體的外形改變較大。在ν3中為不對稱伸縮運動，橢圓體的大小和形狀變化很少，但是其主軸方向改變了(圖中點線部分)。以上水分子的三種振動都有涉及偏極化性的改變，均呈現拉曼譜線。

　　在直線形二氧化碳分子中，也有三種基本振動模式(見圖十五)。在ν1對稱伸縮中，分子的大小發生改變，由此可以斷定ν1是會呈現拉曼譜線的。至於二氧化碳的ν2與ν3，也改變了分子的形狀，或許也可推測其將有拉曼譜線，但是，實際上這二者是沒有拉曼光譜線的。

　　雷射拉曼光譜儀

　　拉曼光譜學又常被稱為雷射拉曼光譜學，這是因為現代的拉曼光譜儀都以雷射做為光源。而在1928年時，拉曼是以太陽光做為光源，望遠鏡為收集器，他本人的眼睛為偵測器，以如此原始的儀器卻觀察到極其微小的現象，真是令人讚歎。

　　雷射具有單色光的及一致的特性，是一種高強度的光源。普通的光源(如鎢絲燈泡的光)混有不同頻率、方向與相位的光，稱之為非一致的光。如果使用雷射，即使微小的拉曼散射也可以被光擴大器(photomultiplier)偵測到。應用電子計算機又可改進訊雜比(signal-to-noise ratio)。(參閱本刊70-9月號盛天予著「雷射原理簡介」一文)

　　市面上有許多種雷射管，其中波長514.5nm(綠色光)的氬離子雷射最常被使用。在共振拉曼光譜法中必須慎選激發的波長，因為所使用的激發波長如果在化合物的吸收光譜內，則化合物的發色團(chromophore)可被共振增強。

　　基本上雷射拉曼光譜儀由以下單元組成：光源、樣品室、單色光器、光擴大器與電子信號處理機(見圖十六)。首先入射光照射到待測物，造成光向四面八方散射，這些散射光包含瑞來散射光與拉曼散射光，而瑞來散射光較強。接著一個聚光系統裝置在與入射光成某一角度的位置，以便收集散射光，所收集的散射光被聚光於雙組單色光器的狹縫上。有時候入射光高於拉曼散射光達109倍之多。所以為了解析出弱的拉曼光譜，需用高效率的光譜儀。在雙組單色光器中，光先後被第一組及第二組的單色光器所分散。光線通過出口的狹縫後聚集至光擴大器管內，然後再將光轉換成電子信號。

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假如雷射提早二十至三十年發明，或許今天拉曼光譜法會比紅外光譜法更流行。

　　現代的拉曼光譜儀可自動的記錄拉曼波數(即入射光與散射光的波數差)和散射光波數的絕對值。傳統上的拉曼光譜儀需較長的時間才可測得完整的光譜。這對比較不穩定的分子而言很難測得其拉曼光譜。近來發展出多重波長(multiwave length)偵測器已可克服此困難。例如已有可在7ns時間內測出細胞色素C(cytochrome C)且解析良好的拉曼光譜。

　　關於拉曼光譜法、紅外光譜法及紫外光譜法的比較請看表一。由表中我們可以看出各種方法都有長處也有短處，沒有一種是萬能的。

　　如果待測物有螢光反應，此時其拉曼光譜常被螢光遮蓋了。此外雜質也常是螢光的來源。如果是蛋白質樣品，可以先在冷房中準備欲測之蛋白質，立刻測其拉曼光譜可以降低螢光干擾的問題。下列方法是一般用來降低螢光的手段：純化待測物、延長雷射光照射時間、選定適當的波長或使用脈動雷射(pulsed laser)。

　　拉曼光譜學在生化上的應用

　　近十多年來，拉曼光譜學已被廣泛應用於生化上的研究。其研究的對象包括蛋白質、、核酸、核蛋白、脂質、細胞膜、碳水化合物、類胡蘿蔔素(carotenoid)、黃素(flavin)與金屬離子在生物中的角色等。本文僅舉一些例子來說明。

　　對生化分子如何判定拉曼光譜的振動頻率代表的意義，經常是利用與它結構相近的模型化合物的光譜頻率互相比較而定的。

　　對生化分子而言，拉曼光譜方法優於紅外光譜的主要原因之一便是水溶液中水對待測物的光譜干擾較小。由圖十七與十八我們可以看出 200至2000cm-1波數範圍內，水的拉曼光譜強度很弱。可是由於溶液中常常只占一小部分，因此水的拉曼光譜仍是很明顯的。

　　一﹑蛋白質

　　蛋白質是由多種胺基酸組成的巨大分子，具有複雜的三度空間結構。沒有一種單獨的物理方法能解出蛋白質的全部結構。X光繞射對於構造解析固然是非常有用的工具，卻局限於晶體物質，而自然狀態的蛋白質是以水溶液存在，晶體的蛋白質結構與水溶液中的蛋白質很可能不全相同。圓光旋差(circulardichroism,簡稱CD)對於水溶液中蛋白質內各種胺基酸之間的胜骨架(如α-螺旋和β-褶片)也是一種研究利器。可是它對蛋白質的支鏈和雙硫鍵無法作有效的偵測。

　　拉曼光譜方法對於待測物是晶體、粉末、凝膠或水溶液皆適用，對於蛋白質的胜骨架、雙硫鍵與支鏈(酪胺酸、色胺酸及甲硫胺酸等)也都能提供有用的訊息。

　　以人的碳酸脫水B(carbonic anhydrase B)為例，其二級結構由拉曼光譜或X光繞射得到的結論十分接近。(見表二)

　　拉曼光譜法對於蛋白質中的酪胺酸可以偵測出它是埋藏在內或曝露於外。如果酪胺酸是被埋藏在內部，則它可做為強的氫鍵供給者(即提供氫原子給鄰近的氫鍵接受者)。此時拉曼光譜上850cm-1/830cm-1的比值為 0.5，即830cm-1的光譜峰較高。反之，若酪胺酸曝露在蛋白質外部，則比值將升高，亦即850cm-1的光譜峰較高。利用這種性質，可以定出埋藏的酪胺酸和曝露的酪胺酸含量(見圖十九)。

　　胰島素的一段結構如圖二十所示，它共有三個雙硫鍵連接六個半胱胺酸(cysteine, Cys)。其中兩個為A鏈與B鏈之間的，另一為A鏈本身內部的雙硫鍵。由胰島素的拉曼光譜(見圖二十一)可以分析出由雙硫鍵-S-S-在517cm-1因伸縮振動而得的光譜強度與505cm-1的光譜強度比值約為2：1。此外由C-S伸縮振動得的668cm-1對680cm-1的強度比也約為2：1。由此種拉曼光譜的證據也證明了胰島素三個雙硫鍵的關係。因為胰島素不含甲硫胺酸，所以觀察到的C-S光譜峰是由雙硫鍵的C-S-S-C得來。

　　二﹑核酸

　　核酸的特徵之一是含有磷雙酯鍵(phosphodiester bond, O-P-O)，源於此處的伸縮振動光譜可用來研究核酸的結構。以DNA為例，雙股DNA主要有兩種結構，A-DNA和B-DNA。有名的華特生-克立克雙螺旋(Watson-Crick double helix)即為B-DNA結構。由於相對濕度的改變，A與B兩種型式的DNA是可以互相轉換的，在水溶液中DNA都是屬於B-DNA。二者的拉曼光譜特徵如下

　　【瀏覽原件】

　　利用兩者之間的光譜差異，可以探討彼此間的轉換(見圖二十二)。

　　三﹑磷脂質

　　磷脂質是構成細胞膜的主要成分。如圖二十三所示，細胞膜的磷脂質親水部分朝外與溶液接觸，我們以小圓圈表示;而離水部分朝內彼此接觸，以短棒表之。

　　如果以下不含細胞膜蛋白質的磷脂質雙層膜為研究模型，加高溫度可以使它從凝膠相(gel phase)變成液晶相(liquid crystal phase，見圖二十四)。由於增高溫度會導致組成磷脂質的長鏈脂肪酸中碳與碳之間C-C骨架的構形改變(見圖二十五)，此時利用拉曼光譜方法可偵測出 C-C骨架的變化。

　　四﹑金屬離子與配位子的結合

　　以血液中的血紅蛋白(hemoglobin﹐Hb)中的二價鐵離子與其配位子(ligand)氧分子結合為例，缺氧的血紅蛋白中的亞鐵離子配位數原本為五，它與氧分子作用時便是以第六個位置去結合的，如圖二十六所示。

　　但是O2與Fe有兩種可能的結合形式，如圖二十七所示。到底那一種形式才正確呢?拉曼光譜也能解答此問題。首先用由同位素16O與18O結合而成的氧分子(16O-18O)來與血紅蛋白作用。因為在Fe-16O或Fe-18O中，亞鐵離子與氧原子的結合強度不同，由此可以預測在鮑林-寇耶爾模型(Pauling and Coryell model)中會呈現兩個相異的拉曼光譜峰;否則在葛里菲斯模型(Griffith model)中會僅出現一個拉曼光譜峰峰(因為在此模型中兩個氧原子的幾何位置是無法區別的)。實驗結果顯示有兩種距離接近的光譜峰，分別位於 567cm-1及540cm-1(見圖二十八)。此外由紅外光譜測出O-O的伸縮頻率，也可證明鮑林-寇耶爾型才是正確的。

　　參考資料

　　1. C. N. Banwell, Fundamentals of Molecular Spectroscopy, 2nd Edition, McGraw-Hill, 1972.

　　2. E. G. Brame, Jr. and J. G. Grasselli, ed., Infrared and Raman Spectroscopy, Part C, Marcel Dekker, 1977.

　　3. S. K. Freeman, Applications of Laser Raman Spectroscopy, John Wiley & Sons, 1974.

　　4. H. A. Szymanski, ed., Raman Spectroscopy, Plenum, 1967.

　　5. A. T. Tu, Raman Spectroscopy in Biology, John Wiley & Sons, 1982.

　　6. N. -T. Yu, C. S. Liu, J. Culver and D. C. O'Shea, Biochim. Biophys. Acta, 263:1, 1972.