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标题:【求助】为什么我的2D结果总是这样？

xyw5[使用道具]
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发表于 2013-12-19 10:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么我的2D结果总是这样？


我们最近跑了很多的蛋白质双向电泳，可是结果总是得不到分开的点，出现的是条纹，如附图；我们用的是18cm 3～10NL胶条，采取主动水化，结果总是不理想，球哪位大师帮忙分析下原因！


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2013-12-19 10:17
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-19 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
方便的话，把具体的操作步骤写下来，这样大家才可以更好地进行评价啊！我的QQ：1026395628，欢迎骚扰！我估计你是聚焦不够！我刚开始做的时候也是这样！
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发表于 2013-12-19 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白样品是经液氮研磨后用2D lysis buffer 提取，上样量为100μg，原样浓度为30mg/ml.采用18cm胶条，3～10NL；聚焦程序为：主动水化30V,6h+60V,6h；200V，30min；500V，30min；1000V，30min；8000V，4h；8000V，60000Vhr；500V，任意时间。第一个8000可以达到，第二个8000只能到7800～7900左右。其他的都可以达到。
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发表于 2013-12-19 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

18cm：rehydration at 20℃ 8Hr
S1 50V 4Hr 快速
S2 500V 1Hr 快速
S3 1000V 1Hr 快速
S4 8000V 1Hr 线性
S5 8000V 72000VHr 快速
用这个程序试一下，考染的话上样量最好大于500微克
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发表于 2013-12-19 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的上样量是100μL原样加300μL水化液，原样样品浓度为30mg/ml，之前那个写错单位了～呵呵
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-19 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下一些建议和意见：
一、原样浓度是3mg/ml吧？是不是弄错了？
二、在保证定量准确的前体下，上样量是可以适当提高，可以提高到500ug以上，一般以600-700ug比较合适。
三、等电聚焦的程序可以在hughbyhc战友的基础上再更改一下：
18cm：rehydration at 20℃
S1 50V 10Hr 快速
S2 200V 1Hr 快速
S3 500V 1Hr 快速
S4 1000V 1Hr 快速
S5 8000V 1Hr 线性
S6 8000V 10000VHr 快速
S7 500V 数小时 维持
四、个人认为主要问题是聚焦时间严重不够。所以导致几乎看不到一个聚焦好的蛋白点。
其它问题欢迎交流！祝好
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-12-19 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白降解了，感觉
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发表于 2013-12-19 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量太小了，蛋白质也没提好
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发表于 2013-12-19 10:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 orangecake 于 2013-12-19 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

上样量太小了，蛋白质也没提好

楼上这位兄弟最近双向跑的怎么样？
贴个图吧
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-12-19 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 H2O 于 2013-12-19 10:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


楼上这位兄弟最近双向跑的怎么样？
贴个图吧

还凑合 那我传一张大家给点意见吧 左边是酸性端 老觉得有点模糊 尤其是碱性端 花糊糊的


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