小中大【求助】双向电泳2D的问题---蛋白点为啥总是集中在正极端
各位能否分析一下我的问题
我做的是线虫的体表蛋白
蛋白是用pbs+urea+chaps+thiourea提取的
抽提过程如下：
1 PBS冲洗样品
2 加液氮碾磨10分钟
3 加入抽提buffer（5M Urea，2M Thiourea，2％ Chaps溶于PBS中）
4 加混合的蛋白酶抑制剂
5 于4°C中，incubate 1.5h
6 100,000*g离心 30min，取上清，即为抽提的蛋白溶液，浓度大概是1000ug／ ml
在2D上样以前我用cleaning up kit 处理了样品
7cm 的胶条，水化时上样 第一向用的是GE的Ettan IPGphor
条件如下
1 被动水化 14hrs
2 300V 30min step&hold
3 1000V 30min gradient
4 5000V 90min gradient
5 5000V 30min step&hold
Total 6.5kVh
水化液的配方
7M Urea; 2M Thiourea; 2% Chaps; 0.5% IPG buffer; 0.002% Bromophenol blue; 18mM DTT(上样前加)
双向电泳后发现蛋白点都集中在了正极（酸性一侧），因为现在的实验室没有做2D的经验，自己摸索了很久还是不得其解，请大家帮忙分析一下，非常谢谢。
