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标题:【求助】BL21转化问题

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】BL21转化问题


构建好的pGEX-6p-1表达载体转化BL21从来没有转化成功过
转化时做了对照，包括转化对照和表达对照，对照也没有长出来。怀疑是公司的感受态问题，又换了一家公司，还是一样的结果，很郁闷……
分析可能原因：
质粒转化DH5a可以，质粒应该没有问题，同理我的转化步骤也没有问题；貌似原因就归结到感受态细胞上了，但是为什么换了两家公司的感受态都不行呢？
问题补充：昨天用公司的感受态自己做了新的感受态，方法如下：将100微感受态细胞加入到5ml的LB中，37度，180rpm培养90分钟左右至OD0.5，然后4度3000rpm离心10min，弃上清，加入5ml预冷的0.1M CaCl2重悬，冰上静置30min，4度3000rpm离心10min，弃上清，加入400微升预冷CaCl2重悬，即为感受态细胞。
接下来的转化过程加入了50ng新提取的质粒，按转化常规操作，复苏45min后加入到4mlLB培养基中过夜摇菌。今天早上过来看发现菌液很澄清，有一些絮状沉淀存在，请各位帮忙分析一下
不知道除了感受态之外还有什么可能的原因？请各位帮忙分析一下
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发表于 2013-12-19 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

复苏45min后.
这一步为什么不铺板呢？操作不规范吧。
直接液体和铺板结果是不一样的
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

之前也试过直接铺板，结果是一样的
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发表于 2013-12-19 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没错，应该铺板。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转质粒的话可以复苏后直接摇菌的，我们实验室大提都是这样的做的。
但是从来没有出现过我上述说的那种情况
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了了[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是抗生素加错了？
是不是培养基已经染菌了？
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抗生素没有错，同样的质粒同时转化DH5a和BL21，用同样的板子，结果是一个能把盘子长满，一个就一点也没有
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yes4[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那看来是BL21有问题了，跟别人要一管在做吧！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恩 今天公司又送来一份新的，晚上重做，做好后再给各位汇报
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-12-19 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接液体培养和铺板结果是不一样的
有时候，铺板能出，但液体培养培养不起来，这个可能菌复苏有关
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