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标题:【求助】让细菌最大程度地特异性表达目的蛋白

eve_49[使用道具]
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【求助】让细菌最大程度地特异性表达目的蛋白


cuturl('http://www.springerlink.com/content/nl2h56409r068877/')
很有意思的一篇文章。
1. 构建双质粒。其中一个带有编码能降解几乎所有细菌本身mRNA的基因。另外一个带有你的目的基因。但目的基因的密码子经过改变,不能为第一个质粒的产物所降解。
重要的一点是,两个质粒都是在iptg诱导下才表达(否则第一个质粒不就把细菌杀了么)
2. 诱导后细菌就成了文中所谓的bioreactor。很有意思。跟大家分享。
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orangecake[使用道具]
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这个思路 比较极端,让细菌集中所有营养和翻译能力,来制造外源蛋白
不知道实际成功的例子有多少
我觉得外源蛋白在转录和翻译的时候,是少不了菌体本身一些酶或者蛋白的辅助作用的
如果菌体本身的这些物质,没有达到一定的丰度,是否也会影响到外源蛋白的产量?
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eve_49[使用道具]
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不过任何系统都有局限性,不可能有放之四海而皆准的东西(非常不幸)
这个系统的优点就是,
1. 背景比较干净(可以说相当干净),所以纯化起来难度大大减少
2. 如果可以浓缩培养体积而不丧失表达水平,在设备和培养基等scale-up问题上节省不少
缺点
1. 楼上提出的。如果有些蛋白需要高丰度的别的蛋白的存在?
2. 需要做codon design。所以必须要有gene synthesis 或者mutagenesis相配套,这一步比较费力,费钱。
所以要做的,就是平衡优缺点,因为每个蛋白的情况都会不一样。
欢迎大家补充。
PS
谢谢版主加分置顶。
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eve_49[使用道具]
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补充一下,
对于第一个优点,对于有些课题来说可能非常重要。
比如,目的蛋白最好不要带tag。纯化后用蛋白酶去除tag当然可以,但有些蛋白在de-tag后会失去活力或可溶性。这样的话这种表达途径就显出好处了。因为背景低所以一些离子交换步骤就可能能纯化目的蛋白。
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orangecake[使用道具]
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现在在原核表达系统里,蛋白的表达量大小,往往是取决于外源蛋白自身的氨基酸序列和结构组成。
对于那些本身表达量就不大的蛋白,不知道用这样的极端体系,表达量是否能改观,我是持怀疑态度的。
对于那些容易表达的蛋白,就算在最简单的表达载体上(pET28此类),也容易过表达,形成包涵体,不需要再提高表达量。
另外我的观点上面也阐述了,抑制自身所有内源蛋白的表达,是否会影响到外源蛋白的转录和翻译?毕竟蛋白表达机制是一个复杂的体系。
不过有人能想出这样的思路,而且用实践手段去尝试了,也是非常不容易的。
这个体系的优点我倒觉得正如amberly斑竹提到的那样,能一定程度上减少菌体本底蛋白量(但是也不会非常明显,因为菌体内源蛋白往往在菌体自我复制的时候就开始,等到诱导时,菌体基本终止复制,大部分的内源菌体蛋白都在那了)
另外或许会减轻外源重组蛋白的胞内酶解。
谢谢斑竹的好文分享,让我们开阔了眼界
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eve_49[使用道具]
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orange道出了我对‘减少背景’的疑问。
我也是这么想的,但看paper上面,目的蛋白丰度是在比背景蛋白高出很多倍,以至于基本看不到背景蛋白。一般的ion exchange还做不出这个效果!
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duoduo[使用道具]
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它的神奇效果


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duoduo[使用道具]
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说实话,我一直没有看懂上图中的电泳背景条带为什么会越来越少。
从中间的图看在诱导开始后的72小时,相同体积的取样量,条带加深不超过3倍,也就是说菌体的增值量不多于3倍。
这个系统仅仅是抑制诱导后的菌体背景蛋白表达,并没有说会促进背景蛋白的消失。
那么,问题来了,诱导前已有的那些菌体背景蛋白去哪儿了?
降解?应该不可能。蛋白质降解也是一段一段的来,不会一下子水解成单个氨基酸。
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remenb[使用道具]
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作者的思路很好啊,不知两个质粒共转后,培养过程中会不会丢失一个呢?
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eve_49[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 remenb 于 2013-12-19 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
作者的思路很好啊,不知两个质粒共转后,培养过程中会不会丢失一个呢?

这个应该不会的,质粒抗性不一样,有不同的origin,不会出现质粒不相容性,所以不会丢失。
就像plys或者codon plus一样。
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