【求助】大肠杆菌高压破碎后除泡

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标题:【求助】大肠杆菌高压破碎后除泡

PCR[使用道具]
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发表于 2013-12-19 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用高压仪破碎BL21，破碎后总有很多泡沫，与平行进行的超声破碎对比效果发现两者破碎后得到的上清，在跑胶时高压后上清的条带都明显较暗，即整个泳道内各条带与超声相比都变暗了。问过别人，他们高压破酵母，BL21时泡沫也不少，讨论后认为泡沫中可能有不少蛋白，故考虑除泡，想请教各位，用什么纯除泡效果比较好又不影响后面纯化的进行，先谢了。

BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-12-19 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

高压匀浆破菌？
我做个几个BL21表达蛋白的比较，高压和超声，电泳没有任何区别。
高压匀浆发热量很大，破菌前菌体悬浮液要预冷的，高压出口容器要冰水浴。
我做高压时没有很明显的泡沫，只是粘度比较大，超声一下就好了。
你的泡沫多也许与破菌缓冲液有关。

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-19 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

泡沫永远是敌人。
有泡沫产生你就要检查你的protocol

PCR[使用道具]
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发表于 2013-12-19 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 BOSS2011 于 2013-12-19 17:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
高压匀浆破菌？
我做个几个BL21表达蛋白的比较，高压和超声，电泳没有任何区别。
高压匀浆发热量很大，破菌前菌体悬浮液要预冷的，高压出口容器要冰水浴。
我做高压时没有很明显的泡沫，只是粘度比较大，超声一下就好了。
你的泡沫 ...

是高压匀浆破碎，使用前预冷了的，但高压出口容器无法控制冰水浴。我缓冲液用的是PB或者PBS，16-17kps破碎，请问难道是我功率过大导致的吗？

PCR[使用道具]
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发表于 2013-12-19 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2013-12-19 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

泡沫永远是敌人。
有泡沫产生你就要检查你的protocol

能说的具体些吗，谢谢。

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-20 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是高压匀浆破碎，使用前预冷了的，但高压出口容器无法控制冰水浴。我缓冲液用的是PB或者PBS，16-17kps破碎，请问难道是我功率过大导致的吗？

============================================================================================

菌用到高压匀浆应该是有一定规模的了，可以请工程部门自制一个金属套管装到高压的出口管上，冰水浴循环降温。
一般高压匀浆机压力单位高限150MPa或1500bar，我们用的是800bar左右，两次。你的压力单位我看不懂。
和匀浆有关的还有菌液比例，不知道你用的是多少？大约在1:8-1:10吧。

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-20 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2013-12-19 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

能说的具体些吗，谢谢。

你要把你的protocol说出来，战友才能看看那个地方有问题啊，不能总叫别人去猜测，然后列出一堆可能的原因吧。这样似乎不是发帖的正道。

PCR[使用道具]
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发表于 2013-12-20 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是我疏忽了，我是用pet32载体转入BL21后，在37℃诱导了6小时，以十分之一比例用PB重悬，加PMSF，预冷，然后高压破碎。至于17是高压仪上显示的数值，kps是师兄告诉我的单位，因为高压仪是别人实验室的，我也是最近才尝试，所以还有很多不太清楚，请指点一二。