【求助】过镍柱纯化蛋白总是得不到单一的目的条带

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标题:【求助】过镍柱纯化蛋白总是得不到单一的目的条带

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-12-20 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近3个月一直在做镍柱纯化蛋白，摸索了很久，还是有些杂带（见图），实在是没有办法了，郁闷的都不想做下去了，但一想到蛋白纯化后就可以做活性研究，马上就有一篇文章可以出来，不做下去心不甘啊，现在请教各位大侠：
我要怎样才可以快速、容易的得到单一的条带，具体有哪些方法，蛋白是要保持活性的，因为接下来要进行其功能研究，先谢谢各位了！！

[ 本帖最后由 owanaka 于 2013-12-20 11:23 编辑 ]

附件

2013-12-20 11:23

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owanaka[使用道具]
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发表于 2013-12-20 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另一张图

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2013-12-20 11:25

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DONT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

透析二次过柱，应该是没问题的

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把条带和泳道标清楚了，一步就能解决

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 DONT 于 2013-12-20 11:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
透析二次过柱，应该是没问题的

我想请教你：我是用醋酸透析的，二次过柱时有醋酸怎么处理呢，可以用有醋酸的蛋白与resin一起吸附吗？谢谢你

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 fox_79 于 2013-12-20 14:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
把条带和泳道标清楚了，一步就能解决

真的能够“一步就能解决”吗，很期待你能赶快告诉我呢，我这一步做了很长时间了，郁闷得很哪
关于把条带和泳道标清楚，我只能在这里补充说一下了，第一张图的后面连续的六个泳道是我过柱后洗脱的蛋白（最后一道是透析后的），第二张图3个连续泳道且在同一位置的是纯化的另外一种蛋白，不知道我说清楚了没有，请多多指教，谢了

DONT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

醋酸透析过的蛋白溶液，按体积加入binding buffer,确定一下PH值在8.0，重新上柱纯化二次纯化。看你现在的蛋白纯度，二次纯化达到大于99%是不成问题的。

fox_79[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 DONT 于 2013-12-20 14:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
醋酸透析过的蛋白溶液，按体积加入binding buffer,确定一下PH值在8.0，重新上柱纯化二次纯化。看你现在的蛋白纯度，二次纯化达到大于99%是不成问题的。

很感兴趣。
请问醋酸透析的原理是什么？透析液的浓度和pH是多少，是醋酸、醋酸钠的缓冲液吗？
按体积加入binding buffer是什么意思？对倍体积加bindingbuffer？
谢谢！

DONT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，误导了
透析很关键，不然无法再次挂柱，和什么缓冲液没关系
楼主用的是醋酸透析，估计PH5左右。
上his柱一般都是大于7.9，关键是PH值，和什么缓冲液也没关系。
剩下的步骤就是一样的了。

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-12-20 14:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

醋酸透析过的蛋白溶液，按体积加入binding buffer,确定一下PH值在8.0，重新上柱纯化二次纯化。看你现在的蛋白纯度，二次纯化达到大于99%是不成问题的。

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谢谢，听了你说的话，心里没有那么郁闷了，好期待有好的结果。还想问问二次纯化与第一次比较是否是一样的操作，没有什么变化吧？

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