【求助】请大家推荐一种带有荧光蛋白基因的原核表达载体

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标题:【求助】请大家推荐一种带有荧光蛋白基因的原核表达载体

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发表于 2013-12-20 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如题，我想把目的基因连接到有荧光蛋白基因的原核表达载体上，然后转染大肠杆菌，得到的蛋白是目的基因产物和荧光蛋白的融合蛋白，可是对载体的选择不太熟悉，请大家帮帮忙给点意见

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发表于 2013-12-20 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

查文献
cuturl('http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n4/full/nmeth0406-303.html')
载体叫pWaldo GFPd 或者e
So Iwata实验室的。日本人在伦敦，呵呵
可以找So 和第一作者要

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发表于 2013-12-20 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还可以在pet28的基础上先构建上去eGFP,然后再融合表达你的目的蛋白
这样比较简易点，也不用麻烦别人，也可以做出带荧光的蛋白
我们做出来过，可以试试

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发表于 2013-12-20 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2013-12-20 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还可以在pet28的基础上先构建上去eGFP,然后再融合表达你的目的蛋白
这样比较简易点，也不用麻烦别人，也可以做出带荧光的蛋白
我们做出来过，可以试试 ...

呵呵，我也想过这么做，不过还是想偷个懒找现成的，如果最后找不到就只有这么做了

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发表于 2013-12-20 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由寻梅于 2013-12-20 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵，我也想过这么做，不过还是想偷个懒找现成的，如果最后找不到就只有这么做了

pWlado 就是pET28 框架的，呵呵
主要是eGFP要注意了，不同的system有不同的mutation
不要拿人家哺乳细胞的用到Ecoli里面，可能发光效率低或者形成聚集的。
Ecoli的跟着Waldo的paper就是了。

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发表于 2013-12-20 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2013-12-20 16:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

pWlado 就是pET28 框架的，呵呵
主要是eGFP要注意了，不同的system有不同的mutation
不要拿人家哺乳细胞的用到Ecoli里面，可能发光效率低或者形成聚集的。
Ecoli的跟着Waldo的paper就是了。 ...

好像eGFP只有一种序列吧？在天然GFP的基础上有几个氨基酸的突变。
我查了一下，我们当初就是从pEGFP-N1这个真核质粒上P下来的序列

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发表于 2013-12-20 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

序列
>EGFP序列
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCA CTCTCGGCATG GAC GAG CTG TAC AAG TAA

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发表于 2013-12-20 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好像eGFP只有一种序列吧？在天然GFP的基础上有几个氨基酸的突变。
我查了一下，我们当初就是从pEGFP-N1这个真核质粒上P下来的序列
另外斑竹您提到的Waldo的paper，能否给个全文？

=======================================================================================

您的序列来源是哪里？
适合原核表达的eGFP有好几个地方有突变，包括了一些fluoresence peak和防止形成多聚体，以及增强信号等。

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-12-20 16:58 资料个人空间短消息加为好友

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原帖由 wmp1234 于 2013-12-20 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
好像eGFP只有一种序列吧？在天然GFP的基础上有几个氨基酸的突变。
我查了一下，我们当初就是从pEGFP-N1这个真核质粒上P下来的序列
另外斑竹您提到的Waldo的paper，能否给个全文？

======================================== ...

我就是从上面贴出的pEGFP-N1这个载体上PCR下来的eGFP序列