蛋白质与蛋白组学

1、菌落PCR的结果不可靠，我们实验室基本上放弃了这种鉴定方法。一般都抽好质粒后再酶切鉴定。
2、从你的结果看，空质粒的可能性比较大。也就是说根本就没有把目的基因接进载体。造成这种现象的原因很多啦，有可能是你的载体就切的不干净，可以拿切开的载体做个转化看看。如果载体切的比较干净，再从连接和载体自连的方面找原因吧。

克隆问题有时候真是很难找到确切的原因啊。
你们同样的方法在其它载体做成功是也是选择的同样的酶切位点吗？
NotI这个位点不知道是为什么，我们实验室有几次选用它的时候都做的不成功。
我个人觉得还是自连的可能性大吧。至于PCR的问题，是否引物的特异性不够？

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1.选择NotI做酶切位点，你有些需要特殊注意的地方，这个酶的酶切效果不是很好，
根据Neb的测试结果，ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT，两边做这样的保护碱基，8个以上，才能保证20h有90%的酶切效率，所以建议楼主重新检查你的酶切位点的保护碱基的设计，如果少于8个，很可能酶切的效率就很低了。
2.使用这样的低效率的酶，建议单独一次一次酶切，每次酶切完跑电泳从胶上纯化，确保每次都是使用完全切割的DNA。不要用双酶切。此外双酶切后，对质粒用去磷酸化酶，去磷酸化，减少质粒自连的发生几率。
3.你的DNA很大，但是你的胶的浓度太大，你的DNA根本没有分开，如果做胶上回收DNA很不利，建议0.8%或者更低的胶。
实验的成功源自每一个细节，好运！
感动于楼主的执着，祝你新年有好结果。

呵呵，看到你想到我最早做克隆，半年连一个都没克隆出来，那个时候那个沮丧啊！
我一开始也这么想，怎么说也应该有阳性的吧，至少也能筛出来一个吧，所以就不断的筛，其实都是徒劳的。而且也不用去磷酸化，想几率问题，肯定有连接进去的！
其实后来发现，其实去磷酸化还是很有必要的，你想一个质粒在溶液中的5，3末端距离总比外来的insert进吧，碰到连接酶怎么会舍近求远找外来的，insert做布朗运动的几率怎么会比一个本身有联系的片段大呢？不信你可以让做模拟的人给你模拟一下，一条线的两端接近的几率和两个自由分子接近的几率哪个更大？
还是一步一步的酶切，一步一个脚印，我不知道你用的什么kit，我这里的PCR回收胶的试剂盒也可以用于酶切产物，其实本质是一样的，都是离子交换柱。

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AXYGEN的回收试剂盒