【求助】肠激酶切割后目的肽分子量变小

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标题:【求助】肠激酶切割后目的肽分子量变小

TAT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好：我的融合肽为9kD,经肠激酶切割后应该出现3.7kD的目的肽和5.3kD的杂蛋白,但切割后跑电泳发现目的肽的分子量变小了。如图：
什么原因呢？是不是我的目的肽自身降解了？还有就是8kD处为何模糊一片而非清晰地一条带？请大家帮我分析分析，国产的和进口的肠激酶我都试过，效果差不多。
注：我的融合肽因含有His致使表观分子量与理论值有差距。

附件

2013-12-20 17:30

89534782.jpg (19.01 KB)

TAT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

忘了标注了
1：未酶切；
2：0.1U肠激酶切割；
3：0.5U肠激酶切割；
4: 1U肠激酶切割；
5：2U肠激酶切割；

uuooii[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

酶切梯度没有做出来。
不知道你的融合蛋白酶切时用量多大，但是EK酶的用量明显太多了，融合蛋白都切没了。
对酶切来说，一定要把梯度明显的做出来，这样可以防止过度酶切。一般选取80-90%左右的酶切效率比较好。
另外，你的小分子蛋白电泳胶做得真是很好，2.5k的marker依然很好，希望能够给大家传授经验。

TAT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢您的回答，我的融合蛋白酶切时是100ug，难道是酶过量将我的目的物非特异性切割？
我跑的是tricine-SDS-PAGE

yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是EK过量，造成非特异性切割。
算了一下酶切用量，分别为：1、0.2、0.1、0.05mg融合蛋白/uEK。
对通常的EK酶切来说都大了。Invitrogen的EK manual给的标准太低了，实际上EK的活性比manual上要高很多的。
建议酶切梯度做32、16、8、4、2、1mg融合蛋白/uEK。
另外，能把你的tricine-SDS-PAGE 详细方法讲一讲吗？包括试剂配制，电泳参数等等。因为蛋白版有很多tricine电泳的方法，但能做出好看的图的不多，大家一同学习一下。可以另外开贴，谢谢。

purrr[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是呀跑的很清晰

TAT[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Tricine-SDS-PAGE:
试剂配制
浓缩胶母液：49.5%T,3%C
分离胶母液：49.5%T,6%C
凝胶缓冲液：3M Tris，0.3%SDS，pH8.45
阳极缓冲液：0.2M Tris，pH8.9
阴极缓冲液：0.1M Tris，0.1M Tricine，0.1%SDS，pH8.25
梳子下孔离分离胶1cm左右
电泳参数：第一阶段，30V，1h
第二阶段，100V，3-4h
电泳完后要用固定液固定1h，再染色
阳极缓冲液用过4-5次后就换新的，用的是伯乐的电泳仪。
但让我很郁闷的是：EK切后的电泳图谱就不好看了，带弥散，找不出什么原因

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发表于 2013-12-20 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

EK 很强悍，而且特异性不是很好。TEV就好很多。
EK的位点是DDDDK，但DDDK， DDK，甚至DK都可能被切。
当然浓度越高特异性越低了。
小分子量gel实在漂亮，谢谢分享。

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发表于 2013-12-20 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议看一下蛋白的氨基酸序列，如果碱性氨基酸偏多，蛋白带的正电多，跑出的条带就会偏大；反之，则会偏小，看起来就是分子量变小，可能事实上没有改变，你可以在其他方面验证，这两条带就是EK酶切出的。

BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-12-20 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用软件估算了我的目的物的等电点，大致是4.23，在这种情况下应该带负电荷，但愿如您所说的事实上没有改变，请教您：我怎么在其它方面验证两条带就是EK酶切出的？还有怎么验证那条小带就是我的目的物呢？

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