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标题:【求助】蛋白聚合体的激光共聚焦制片

is2011[使用道具]
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发表于 2013-12-20 22:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白聚合体的激光共聚焦制片


我做的是植物的一种蛋白聚合体，想用激光共聚焦扫描技术做下电镜，这个制片有什么要求吗？哪儿有关于这方面的制片教程之类的？各路大侠，请不吝赐教！！在线等~~~~~~
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uuooii[使用道具]
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发表于 2013-12-20 22:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这个说法挺有意思，
激光共聚焦的根本就是pinhole的设置，可以控制你扫描的厚度，
而电镜如果是扫描电镜表面要导电，观察的是轰击出来的二次电子，只能看到5-50nm的厚度的信息，可是confocal的步长是由激光束的波长限制的，几百纳米的时候都已经有重叠了，而且电镜的穿透能力也不强，如果lz说是用透射电镜，要真空条件，你的蛋白怎么保存呢?但是貌似跟confocal又没关。
你这个说法怎么来的，有文献么？给个链接看看？
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-12-20 22:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


相关疾病：
盲
说说你的实验的目的？
做蛋白的confocal，还真是没有做过，
不过估计你是想看类似结构的信息，比如是几聚体之类的，
不过confocal一般的步长比较大，而且分辨率不够，大概在200-300nm左右，基本是极限，最好的能到15nm，不过貌似国内还没有这样的仪器（但是原理已经改变，也有可能是纤维storm，一次出三维结构，不过这个东西的商业化好像还没有这么快，这是哈弗的一个光学实验室的技术）。但是也不足以做你要的信息，对于单个的蛋白质，比如球蛋白，BSA大概是5nm左右，你可以估算一下你的蛋白的大概尺度。光学confocal肯定不够，电子的没见过，可能是孤陋寡闻
我估计你可能是用电子显微镜，然后做单颗粒的构象重构，能够得到一些类似结构信息。
或者你的颗粒比较大，可以试着做一些DLS（动态光散射），看看大致的大小，然后跑SDS-PAGE加native-page来看看你蛋白是几个聚合在一起的等等。这些要比单颗粒的重构简单，快速。
不过做实验前先描述好你的实验目的，否则你的实验选择是很盲目的。
如果你真找到了电子显微镜的confocal，记得把链接发出来，我也想看看这个东西
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发表于 2013-12-20 22:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手，这个原理都还不怎么懂，所以想求一些教程，和制作匹配的片子的技术步骤。让楼上见笑了。看来您是个中高手，还请您赐教点，谢谢，呵呵。
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发表于 2013-12-20 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高手，您说的这些个我都还不懂，继续学习中。
老板只是指了个大概方向，这种蛋白聚合体是多聚体，尺度估计蛮大的。
之前使用Micromeritics Saturn Digisizer 激光粒度仪做过粒径分析。上confocal只是扫描个直观图像，估计老板是这个意思。刚开始，还在摸索中。
期待您提供点教程其他材料的相关方法之类。感激不尽！
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发表于 2013-12-20 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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盲
老板总是这样，模糊的指一条路，很可能都是瞎路，
想看样品制备来看这里，confocal原理以及样品制备看看这里，这是普渡的给研究生的一系列讲座。
cuturl('http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm')
不过你既然已经做过粒径分析，应该已经知道大概大小了，直径能到200nm以上？
而且你的东西有荧光么？或者你有抗体？
你试试看吧
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发表于 2013-12-20 22:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
总的来说就是通过控制可透过的激发激光的量和接受的激光的量来控制你观察的厚度。
如果你还是觉得理论太难，还是直接找一个有confocal的实验室，看一遍他们的仪器，直接讨论更容易理解，最好能带上你老板。
一般做细胞成像的好一点的实验室应该都有
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发表于 2013-12-20 22:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢。
学习中，这个蛋白聚合体是由高低分子量不同的两种单体蛋白通过二硫键聚合的，两种单体数量不同，则大聚合体的粒径大小就不同。总的来说非常大，粒径分布范围在0.37-245μm之间。就看一下不同粒径的数量分布。这个的话，用confocal是做不了？而且它不是荧光蛋白，抗体的话也没查到有。唉，晕死~~
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-12-20 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通过二硫键键和成这么大的？每个蛋白质都是单数的cys吧，
粒径还不均匀？我们如果遇到这种情况认为就是aggregate了，呵呵（玩笑了，可能你的情况不同）
如果是这么大，你彻底提纯以后，建议去做扫描电镜（SEM）
你有机会去跟你老板验证一下，我觉得他有可能是说的电镜
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is2011[使用道具]
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 小中大

不管是用哪个，这个激光共聚焦的技术都想了解学习下。楼上GG有中文的介绍么？英语不太好~~汗
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