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标题:【求助】120kd,130kd转膜条件

芙蓉宫主[使用道具]
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【求助】120kd,130kd转膜条件

目的蛋白是120和130kd,几次都没有出目的条带,但是内参b-actin出的还好。
这两次转膜后对胶考染,发现100kd以上的片段,残留很多。不知是不是转膜不完全引起的目的蛋白条带未出。
尝试过的的转膜条件是:300mA,2h.
70V, 6h.
谢谢大家,不吝赐教!
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ROSE李[使用道具]
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你分离胶用的多少浓度的?
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birdfish[使用道具]
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蛋白的分子量比较大,转膜的比例就会下降,就是转过去的量小于小分子量的蛋白的转膜比例,我以前做的200KD以上的,大概是350mA转2个小时,转膜液中加了SDS有助于提高转膜效率。分离胶估计要用8%的。跑胶时间要长一点。祝早日成功!
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yychen[使用道具]
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我做的是114的55ma 6h条带很好。但是170的没出来条带。
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谢谢楼上两位!!!
我用的分离胶是8%的。
能问一下sunshine0378 ,你在转膜液中加了多少SDS吗?我在转膜液中加入的甲醇比例是15%,这个比例可以吗?
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wu11998866[使用道具]
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我做的是114的55ma 6h条带很好。但是170的没出来条带。
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ero11[使用道具]
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我以前做过120KD的western,条件如下:10%的分离胶,转印电压120v,转印时间120分钟,转印液配方:tris(3.03g),甘氨酸(14.4g),甲醇(200ml),去离子水定容至1000ml。
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birdfish[使用道具]
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我以前做过120KD的western,条件如下:10%的分离胶,转印电压120v,转印时间120分钟,转印液配方:tris(3.03g),甘氨酸(14.4g),甲醇(200ml),去离子水定容至1000ml。
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芙蓉宫主[使用道具]
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谢谢各位!
我们现在用的是RIPA 裂解液,不知道提出的蛋白能不能有问题
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sunnyB[使用道具]
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将甲醇浓度降到10%试试
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