小中大【求助】western总出不来，想哭！
从开学到现在一直在做western,只出过一次结果．现在每次都是白片儿，连actin都没有．老板天天给脸色看，急的都睡不着．
我的目的蛋白是１３０kd和１９kd.
上样量从１０－３０微升都试过，就是没有结果．一般都是８０v跑浓缩胶，基本上很快就跑进分离胶了，一直很纳闷大家为什么都可以跑那么久？１２０v分离胶，基本上要２－２．５h，让溴芬兰跑出．湿转，六一的，１５０ma,2h.染胶染膜，每次胶上要摸没有，要摸就有一点点．膜上每次都有，而且，我要得目的条带的位置总是有，actin的位置也有，所以我确定转膜应该没有问题．
牛奶封闭，室温１h,或者４度过夜都试过．一抗１：１００－１０００都试过，二抗１：２０００，actin１：１０００，（都是santa的)一抗过夜，二抗ＲＴ，１h,洗膜３次＊１０min．ＥＣＬ发光液孵育２分钟，暴光．什么都没有．
我现在一看到暗室，就哆嗦，已经有心理阴影了．打击的不行了．
大家帮我分析分析吧．
感激涕凌！
[ 本帖最后由 any333 于 2013-12-21 09:08 编辑 ]
