【求助】内参可以,目的蛋白条带很虚很浅

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标题:【求助】内参可以,目的蛋白条带很虚很浅

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参作的可以,但目的条带很浅很虚,是不是应该加大一抗的浓度?转膜后丽春红染色颜色不深,是不是要延长转膜时间?

小游abc[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2013-12-21 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

内参作的可以,但目的条带很浅很虚,是不是应该加大一抗的浓度?转膜后丽春红染色颜色不深,是不是要延长转膜时间?

不知楼主是双标还是单标，即内参和目的条带的一抗是混在一起孵育膜？
如果是那就只是调高目的条带的一抗就可以。
如果不是，建议楼主先增加目的条带一抗的孵育时间和曝光时间试试看，应该会有所改善。
假如还是不好，就增加目的条带的一抗浓度吧。
good luck

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分开孵的,条带虚的话最可能和一抗有关么

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发表于 2013-12-21 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

条带虚且杂带很多,也要提高一抗的浓度么

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二抗的孵育时间的影响大不大

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是这个情况，目的条带很浅，杂带多，我想这次增加二抗孵育的时间。
好吧，二抗孵育时间不是我看不到条带的原因

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发表于 2013-12-21 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也是这种情况，内参每次都做的很好，但目的条带很淡，有时候背景又高，正打算加大上样量，不知道行不行，急求高人指点！

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的蛋白的丰度是否过低？如果是内源，那不好办，得增加上样量。如果是外源，先看下转染的效率是否高。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参 36kd 目的蛋白 125kd
跑胶浓缩胶5% 分离胶10% 先跑70V,再跑120V,溴酚蓝跑到底停
25V转膜过夜(约12h,北京六一电泳仪),5%脱脂奶粉室温封闭2小时,一抗(santa,1:50,因为考虑抗体一年半了,效价降低)室温两小时,二抗(1:4000)室温两小时
目的蛋白能做出明显的条带,但不确定是不是我的125kd 的蛋白,因为照marker 的位置来说,好像不是,请帮忙看一下步骤有没有缺陷的地方

BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-12-21 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转膜 300mA 120min
封闭 3% BSA in PBST
一抗 4度过夜
你的内参和目的蛋白分子量差距很大，考虑跑梯度胶

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