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标题:【求助】为什么背景是黑的，而带是白的？

misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么背景是黑的，而带是白的？


这几天一直忙着做膜蛋白的WB，今天似乎好像要出结果了，可是洗出来的胶片呈现：背景是黑的，而我要得带是白的,为什么呢？我又把膜重新洗了（TBST），这回背景是浅了，可是带却没了？我觉得是不是我的二抗浓度太高了呢（1：2000）？所以使显影液在瞬间爆发而成为白色呢？但是在显影液的detection时，我并没有看见带啊？我在暗室中等着眼瞅着膜的（暗室的确是相当的黑）。为什么嗫？我们实验室的WB高人说，做了一辈子WB，也没见过这么怪的现象。所以，我只能请教国内的各位高手，帮我分析一下。谢谢！
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one[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 misswu61 于 2013-12-21 15:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这几天一直忙着做膜蛋白的WB，今天似乎好像要出结果了，可是洗出来的胶片呈现：背景是黑的，而我要得带是白的,为什么呢？我又把膜重新洗了（TBST），这回背景是浅了，可是带却没了？我觉得是不是我的二抗浓度太高了呢（1：2000）？所以使显影液 ...

高人做了一辈子了啊
不容易
做了这么长时间肯定会碰到这样的问题了
我碰到过这样的问题
1，抗原上样量过大
2，一抗与二抗浓度太高
你调整试试
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我今天也遇到这个问题，一摸一样啊，背景黑乎乎，目的条带相比之下感觉是白的了
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量太大么？我的上样量是20Ug，一抗1：500，二抗1：2000（似乎高了）
用5%奶粉封闭1h（时间短了）
中间TBST洗脱部分都是10Min*3次
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有问题很正常啊
要把问题解决了
调整抗体浓度
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zzzz[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哪个公司的二抗？KPL，JACKSON？如果是的话，用1：10，000或更高吧。二抗太高的可能性大些。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是分装的JACKSON的2抗，推荐浓度时1：5000-100000啊
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发表于 2013-12-21 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜出现反像（白色带）
可能的原因：HRP含量过高。
解决途径：降低酶联二抗的浓度。
推荐浓度是1：5000-100000，你用到2000，自然是太高了。
建议降低二抗浓度，再试试。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-21 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的一抗、二抗，均是santa Cruz，今天我已经把二抗换成了1：5000，可是涛声依旧。我的老师们建议我把一抗加高，二抗依旧1：5000，再试。明天就知道结果了，洗液又换回PBST。我们实验室自来二抗都是1：2000，很少用1：5000。今天有个老师也帮我重做了WB，她也明天出结果。或许是手法的问题，我的手忒臭？郁闷！
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orangecake[使用道具]
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 小中大

是啊，今天把2抗的浓度降到1：6000，感觉背景干净多了
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