【求助】质谱分析出差异蛋白后下一步处理

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标题:【求助】质谱分析出差异蛋白后下一步处理

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好! 最近做了一个血清的质谱分析,得到4个差异蛋白,想请教一下下一步验证试验怎做? 也查了一点内容,有建议用westen 的,但不知目前具体步骤怎做?尤其是若有抗体试剂的情况下.多谢了

flower-201[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顶!有的做定量PCR，大家有深入做下去的吗，麻烦传授经验

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有抗体试剂的情况下,文献多用ELISA方法进行大样本验证，且可定量，优于western

seven7[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2013-12-21 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 seven7 于 2013-12-21 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这首先得看你是怎么得到这些差异蛋白的,比如是通过双向还是色谱分离,这对后面如何决定会有一些影响.
我觉得首先应该考虑用Western 验证,因为毕竟都是蛋白水平的变化.尤其是有特异性抗体的情况下.但是因为血清样品可 ...

mRNA水平，RT-PCR引物怎么设计的？

PCR[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mRNA水平，RT-PCR引物怎么设计的？

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2013-12-21 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
mRNA水平，RT-PCR引物怎么设计的？

做双向质谱结果只知道蛋白序列，如何根据蛋白序列，设计mRNA的引物

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发表于 2013-12-21 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想请问一下，质谱之后做western的具体作用是什么？？谢谢！

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发表于 2013-12-21 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不推荐单独做RTPCR，我想做蛋白组的人心里都清楚，质谱得到的差异的准确度是多少？每次的肽段覆盖率又能达到多少？而楼主又重复了几次？如果重复七次以上还得到了这样的结果，基本可靠。随后可以做western验证。
为啥不推荐单独做RTPCR呢，因为RTPCR是反映的mRNA的水平，而大家都知道蛋白质是有转录后修饰的，就像我们知道你离开家了，但是不能说你一定会出现在教室里面吧。比如蛋白质被泛素化被降解，被脂化等，你在质谱里面很难看得到啊。
所以你要用western blot来验证你的差异是否准确，但是这必须是在有内参的情况下。Elisa的作用类似，但是做过Elisa的人都知道，其可靠性不怎么样，假阳性很多。

idoww[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这首先得看你是怎么得到这些差异蛋白的,比如是通过双向还是色谱分离,这对后面如何决定会有一些影响.
我觉得首先应该考虑用Western 验证,因为毕竟都是蛋白水平的变化.尤其是有特异性抗体的情况下.但是因为血清样品可能在裂解过程中,某些蛋白很难充分溶解,所以跑的Western不一定漂亮.如果蛋白水平无法验证,那就试试mRNA水平,也就是RT-PCR什么的.
血清那些蛋白难溶解，既然你能在质谱里面看到，说明已经可以跑在电泳里面或者溶解跑色谱了，怎么可能还有难溶解不能用western重复的蛋白质？？

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有人说western无法验证，western不可靠，难道质谱就可靠么？
western的灵敏度是多少？质谱的灵敏度加置信区间又是多少？
所以说，如果你无法用western验证，不要单独用质谱的数据说事....