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标题:【求助】蛋白纯化问题

杨过爱大米[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化问题


我看到一种重组蛋白注射剂，含有生育酚、卵磷脂。不清楚蛋白怎么会用到这些抗氧化剂和乳化剂，作用何在？溶剂是水吗？这些信息针剂上没有。
我打算用硫酸铵沉淀法，除掉生育酚、卵磷脂，获得其中的蛋白，可行否？
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DONT[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我查了一下，生育酚的分子量430左右、卵磷脂可能是混合物，但分子量也都小于1000。
所以用透析法来去除这两种物质应该比较好。当然这个重组蛋白的分子量不会小于5000吧？
用硫酸铵沉淀可能有问题，因为一方面有些蛋白高浓度的硫酸铵也不会沉淀，
另一方面，重组蛋白注射剂可能其中的蛋白含量很少，即使硫酸铵沉淀对这种蛋白有效，由于浓度的关系，硫酸铵沉淀也难以完成。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果没猜错的话剂型可能是乳剂,这样卵磷脂会形成团状结构,分子量就大了,而且浑浊液体中也会包裹蛋白和生育酚,透析等方法估计难得到蛋白,沉淀也难,只能先破乳或直接提取后才能进一步浓缩等.估计关键在提取.
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杨过爱大米[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

生育酚，脂溶性；卵磷脂，两性，但只溶于乙醚、氯仿、乙醇等。是否可以先皂化，生育酚、和卵磷脂都成水溶性物质，也就破乳了。然后透析？
问题：既然是乳化剂，估计该蛋白溶解性也不好，透析中该重组蛋白（大概200个氨基酸）是否会沉淀变性？
硫酸铵沉淀：该针剂只有一种蛋白成分，其他的生育酚、卵磷脂都是小分子，蛋白浓度标称250mg/mL，沉淀法似乎可行？而且浓度似乎太高，由观点认为2.5-3%的蛋白浓度比较适合盐析。而该针剂的蛋白浓度换算出来大概25% （250mg/mL）。用10%的乙醇溶液稀释后再加固体硫酸铵，如何？因为没有其他蛋白，应该不用考虑蛋白共沉淀干扰问题。
问题：盐析时因为乳化体系被破坏，卵磷脂是否会沉淀？脂溶性生育酚估计在水面，最担心的是卵磷脂会沉淀，这样和蛋白就混在一块了。
文献报道，血清样品中该种蛋白的提纯步骤：第一步，Ammonium sulfate precipitation------第二步，solid-phase extraction （C4 SPE）------methanol preicpitation (-20度进行)。
各位，有何评论？
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杨过爱大米[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

卵磷脂应该是用做稳定剂，防止蛋白的聚集，生育酚是用于防止卵磷脂中PC的氧化
----引自DP84站友评论
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 杨过爱大米 于 2013-12-21 16:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

生育酚，脂溶性；卵磷脂，两性，但只溶于乙醚、氯仿、乙醇等。是否可以先皂化，生育酚、和卵磷脂都成水溶性物质，也就破乳了。然后透析？
问题：既然是乳化剂，估计该蛋白溶解性也不好，透析中该重组蛋白（大概200个氨基酸）是否会沉淀变性？
...

只看第一楼信息的话，我担心的是单只针剂里的蛋白太少，也许是ug级的。但看到说是250mg/ml我却有点疑问了，浓度太高了吧？
不过这不影响我的建议：用适当的溶液溶解且需要让生育酚，卵磷脂不与蛋白结合在一起，然后过脱盐柱就行了。有所顾虑的就是蛋白脱离了生育酚、卵磷脂的环境是否会沉淀。所以合适的溶液是关键。
如果生育酚，卵磷脂不是助溶剂而是辅助治疗的药剂的话，嘿嘿，我对这个药的功效倒是挺好奇的，哈哈。
祝顺。
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杨过爱大米[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用适当的溶液溶解且需要让生育酚，卵磷脂不与蛋白结合在一起---------针剂中生育酚和卵磷脂适合蛋白结合状态吗？
如果如DP84所言，卵磷脂是稳定剂（乳化剂）,生育酚是抗氧化剂，那么这两者应该是不是结合状态，对吧？
有所顾虑的就是蛋白脱离了生育酚、卵磷脂的环境是否会沉淀。------这确实是我最不确定的。
250mg/ml我却有点疑问了，浓度太高了吧？------标签标称浓度。
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杨过爱大米[使用道具]
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发表于 2013-12-21 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用适当的溶液溶解且需要让生育酚，卵磷脂不与蛋白结合在一起，然后过脱盐柱就行了。------我就是想用乙醇溶液，溶解生育酚、卵磷脂，达到破乳，然后硫酸铵盐析；过脱盐柱也是好办法，如果上脱盐柱，透析应该也可以用了。卵磷脂有人说乙醇也较难溶，所以，估计最后很难达到完全破入或者澄清状态，因此，我觉得盐析方法可能较好。
希望楼上各位站友继续指点，多谢各位帮助！
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杨过爱大米[使用道具]
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 小中大

卵磷脂在重组蛋白针剂中的作用是否为脂质体，其作用是来载药（重组蛋白）？
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ritou1985[使用道具]
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 小中大

只有卵磷脂是成不了脂质体的！
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