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标题:【求助】85KD的蛋白浓缩胶浓度及转膜条件

pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】85KD的蛋白浓缩胶浓度及转膜条件


在做PI3K的亚基P85的westernm,SDS浓缩胶浓度最好多少啊？以及转到0.22υm的NC膜的转膜条件?请教了.
用12%的浓缩胶跑SDS-PAGE,60V 2小时转膜做过,只做出了36KD的内参.
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

8% SDS PAGE
300mA 90-120min
PVDF膜
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发表于 2013-12-21 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pencil菲 于 2013-12-21 17:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

8% SDS PAGE
300mA 90-120min
PVDF膜

用了哪家的抗体？
用什么提取的蛋白？
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发表于 2013-12-21 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用8%或10%的SDS-PAGE
PVDF膜，转膜恒流500mA,约1.5小时
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发表于 2013-12-21 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么要用PVDF膜呢？0.22υm的硝酸纤维膜不行吗？恒流比恒压会好一些吗？
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用了哪家的抗体？
用什么提取的蛋白？

====================

用了CST的抗体。
用RIPA裂解液提的蛋白。
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

10-12%即可，半干转，16V35min左右应该转上去
个人更喜欢PVDF膜，实用，方便
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用8%或10%的SDS-PAGE
PVDF膜，转膜恒流500mA,约1.5小时

============================================================================================

你肯定没有记错？
如果是半干转，500mA？你多大的胶啊，2D的胶么？
Biorad的小胶，我95mA，30min都可以看到70kD和100kd的条带，就算是要完全转，需要1.5h么？而且那么大的电流？
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-12-21 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
8% SDS PAGE
300mA 90-120min
PVDF膜

==========================================

这个可以，10%的也可以，300mA，建议110-120分钟
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