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标题:【求助】凝胶过滤层析的问题

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发表于 2013-12-22 11:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】凝胶过滤层析的问题


我在做细菌胞内蛋白分离纯化，粗提物直接上凝胶柱后，有几处峰形分不开，不知道怎么可以改善一下，希望高手可以指导下。还有，就是一位老师帮忙分析说有的峰在280nm吸收峰很低可能不是蛋白，我想知道到底怎么可以确定是不是蛋白。
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发表于 2013-12-22 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE电泳。
分子筛柱分不开峰非常正常。特别你是拿粗提物去做分子筛柱。不合理。
由于分子筛柱受到上样体积的限制，一般分子筛柱用于最后的精细纯化，除去微量的杂质或多聚体。
还是先试试离子交换柱、疏水层析柱等吸附层析的纯化方法吧。
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发表于 2013-12-22 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白等电点在4左右，分子量约180kDa，四聚体。请问选用那种离子交换柱比较好呀？
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发表于 2013-12-22 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的缓冲液pH为7.0
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发表于 2013-12-22 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白纯化系统是什么公司的？是不是高压系统？如果是常压的，峰型有影响，也会对分离效果有很大影响。
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发表于 2013-12-22 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白等电点在4左右，分子量约180kDa，四聚体。请问选用那种离子交换柱比较好呀？

===========================================================

Q柱吸附试试看，注意样品的电导不要高了。
你应该再多给些条件，例如，重组蛋白、有无tag、表达情况、可溶否等。
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花想容[使用道具]
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发表于 2013-12-22 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #6 大尾巴 的帖子

哦，我是直接在细菌中提取的蛋白酶，没做工程菌
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发表于 2013-12-22 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先上阴离子交换正解
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发表于 2013-12-22 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以用考马斯亮蓝测总蛋白含量，上凝胶以前最好先浓缩上阴离子交换柱。
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