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标题:【讨 论】融合蛋白片段对于目的蛋白片段的活性影响

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发表于 2013-12-23 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨 论】融合蛋白片段对于目的蛋白片段的活性影响


最近做HIV蛋白片段的时候，发现有些蛋白片段对抗原的活性影响很大，有时候会使目的片段失去活性。融合蛋白片段是相对比较惰性的片段，怎么会有这么大的影响呢？蛋白片段对目的片段有怎么样的影响呢？
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
举个例子。
采用PET32a质粒融合表达时，融合片段上有一个cys，很可能与目的片段上的cyc形成二硫键，从而影响到了目的片段的空间结构，目的片段的活性也许会受到影响。其它的如histag等都有影响。
蛋白质的活性是由其空间结构所决定的，加上一段融合蛋白，必然会对原来的结构有影响。而结构影响到功能，所以不能说融合片段是“惰性”的。平常我们说惰性，只是我们用到的某种检测方法对这种结构的变化不敏感而已。例如作为抗原来检测抗体，或许抗体识别的那一段抗原表位结构没有变化。
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发表于 2013-12-23 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 summerxx 的帖子

谢谢。某些蛋白在包被和标记HRP的过程中活性会有损失，所以用在EIA上面重组的抗原一般是要加上一段融合蛋白的，以是保护目的蛋白区段。融合蛋白在其他方面还有什么重要作用呢？
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发表于 2013-12-23 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“重组的抗原一般是要加上一段融合蛋白的，以是保护目的蛋白区段。”恐怕没有这个说法。
其它作用有促溶、增加半衰期、增加免疫反应、利于纯化tag等等。
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阿凡提[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“抗原的活性”是个什么东西？
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发表于 2013-12-23 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果说表达的蛋白用于功能实验，其融合蛋白是否对活性有影响？一般来说，好像切掉Histag后，蛋白的功能实验更能说明问题，但如果不切除Histag，能否当做活性蛋白来做功能，其表现的功能有无说服力？疑惑中
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发表于 2013-12-23 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 阿凡提 于 2013-12-23 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

“抗原的活性”是个什么东西？

“抗原的活性”我的理解就是能与抗体结合的活性，或者说Elisa活性。
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发表于 2013-12-23 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ending 于 2013-12-23 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果说表达的蛋白用于功能实验，其融合蛋白是否对活性有影响？一般来说，好像切掉Histag后，蛋白的功能实验更能说明问题，但如果不切除Histag，能否当做活性蛋白来做功能，其表现的功能有无说服力？疑惑中 ...

功能实验中融合蛋白是否对活性有影响是不能确定的，做了实验才知道。还要看是那方面的功能。
对免疫检测（金标、酶标、WB、光免）来说，histag影响的往往不是其活性，而是假阳性问题。
如果是做多抗，histag也是有影响的，会产生不想要的抗体。
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发表于 2013-12-23 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢summerxx的解答。我说的蛋白活性就是指抗原与抗体的结合能力，主要是用于EIA和金标方面的。
最近我们在用一些植物中的惰性蛋白区段用于做融合蛋白，效果还不错。不知道大家在这个方面有什么好的见解。用植物中的蛋白做融合蛋白的好处就是和动物蛋白尤其是人的差异比较大，可以有效的降低非特异性的反应，也就是说可以有效的降低假阳反应。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #9 @STAR@ 的帖子

用惰性蛋白区段用于做融合蛋白在检测上用的目的可能在于增强其可溶性，提高表达量，另一方面可能在相邻的抗原表位片段中间加上一个间隔，以利于空间构象的形成或抗原表位被抗体的识别。
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