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标题:【求助】比较奇怪的膜蛋白的表达，目的带怎么这么复杂？

人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】比较奇怪的膜蛋白的表达，目的带怎么这么复杂？


如图所示，泳道1，2，是诱导2小时结果，1，2仅上样量不同，泳道3，4，是诱导5小时结果，3，4仅上样量不同，6是空白菌对照，7为Marker。
如图箭头所示，表达后，出现好多条表达带，仅仅绿色箭头对应的条带 与预测蛋白分子量大小相等。
我表达的是某细菌一跨膜蛋白，跨膜两次。


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2013-12-23 15:53
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 人小鬼大 的帖子

别的不一定是表达的,你上样量不同所以看起来比对照浓
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发表于 2013-12-23 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 人小鬼大 于 2013-12-23 15:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如图所示，泳道1，2，是诱导2小时结果，1，2仅上样量不同，泳道3，4，是诱导5小时结果，3，4仅上样量不同，6是空白菌对照，7为Marker。
如图箭头所示，表达后，出现好多条表达带，仅仅绿色箭头对应的条带 与预测蛋白分子量大小相等。
我表达的是某 ...

楼主只是一个考染，不必大惊小怪的：
1、首先楼主的1、2、3、4不同上样量是成功的，明显条带粗细不一样。
但是不知楼主注意没有，条带的宽窄也不一样，说明楼主上样体积没有调平，虽然无关大局。
2、如图箭头所示，表达后，出现好多条表达带，仅仅绿色箭头对应的条带 与预测蛋白分子量大小相等。
楼主要注意，考染的条带不完全是你要的目的条带，还包含了同样分子量的非目的蛋白。
建议楼主继续往下做，最终的曝光结果才是最终的结果。
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发表于 2013-12-23 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高于目的分子量的条带可能是变性不完全的多聚体，增加样品制备时loading buffer加入后的加热时间试试看，延长至5min以上。
低于目的分子量的条带可能是目的蛋白降解所致。
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发表于 2013-12-23 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 skytree 于 2013-12-23 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

高于目的分子量的条带可能是变性不完全的多聚体，增加样品制备时loading buffer加入后的加热时间试试看，延长至5min以上。
低于目的分子量的条带可能是目的蛋白降解所致。 ...


thank you very much.
but that is the result of boiling 10min.
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人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

this is the result of western blot with anti-his antibody.
so what do you think about this?
why there are too many bands?
(the size of the band: 23 kda, 46 kda, 58kda and more than 58kda respectively.)
23 kda is the right size of the protein.
46 kda may be dimer, but what is 58 kda?
thanks anyone who helps me to think about this....


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2013-12-23 15:55
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skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

loading buffer中有没有加还原剂？
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人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-12-23 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 skytree 于 2013-12-23 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

loading buffer中有没有加还原剂？

added
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-12-23 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

盐酸胍处理下，如果真的是与自身或细菌其它蛋白的多聚体，处理后应该不会再有了，另外如果你的是可溶胞内表达还有降解产物干扰的可能
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人小鬼大[使用道具]
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发表于 2013-12-23 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 huifeng0516 于 2013-12-23 16:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

盐酸胍处理下，如果真的是与自身或细菌其它蛋白的多聚体，处理后应该不会再有了，另外如果你的是可溶胞内表达还有降解产物干扰的可能

用尿素处理，结果基本一样啊。。。
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