小中大【求助】His重组蛋白纯化
我表达的是一个71KD的重组蛋白，带6His标签，亲和基质用的是GE的HisTrap FF（1ml）
缓冲液条件为（均是说明书上推荐的）：
结合buffer：20mM磷酸盐，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH7.9；
洗脱buffer：20mM磷酸盐，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.9；
洗脱方法：线性梯度洗脱（用的伯乐的蛋白纯化系统）
现在的问题是：线性梯度洗脱下没有明显的洗脱峰（如图1）。于是我拿纯化前样品和图中未挂柱部分进行了SDS-PAGE。电泳结束之后，先用InVisionTM His-tag In-gel Stain（特异将带his的蛋白染上荧光）染色，再用考染（图2是InVisionTM His-tag In-gel Stain染色结果，图3是考染结果）。
高手帮我分析一下，问题出在哪？“未挂柱”部分用Ni的染料染不出任何条带，但考染有较浅的条带，我现在搞不清是我的蛋白没挂上，还是挂上了没洗下来！
