【求助】我蛋白质电泳跑出来了，请大家帮忙看一下

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标题:【求助】我蛋白质电泳跑出来了，请大家帮忙看一下

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢进这个贴子的人！
十分感谢！
我做的是乳酸球菌表达胆盐水解酶。
已经研三了。
好不容易转进去成功了。
现在蛋白质电泳也有预期位置的条带出现。
现在面临的是活性问题！
我的不是分泌表达。
而如果用western blot来做活性的话。
抗体就得订做三个多月！
那我就来不及毕业了！
求助于大家要如何做活性？？
关于胆盐水解酶我只知道它遇到牛磺胆盐会形成白色沉淀圈！
但是那是那个菌分泌表达的情况啊，可以直接加在培养基里。
求助于大家！！
T-T！

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 qhyu 于 2013-12-23 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢进这个贴子的人！
十分感谢！
我做的是乳酸球菌表达胆盐水解酶。
已经研三了。
好不容易转进去成功了。
现在蛋白质电泳也有预期位置的条带出现。
现在面临的是活性问题！
我的不是分泌表达。
而如果用western blot来 ...

wb做活性？你指的是免疫鉴定吧，没有抗体是比较麻烦。
乳酸菌不做wb能看出表达，说明你的蛋白很多了啊，表达量不低。
带tag没，有的话搞个亲和柱纯化点出来测活，应该不是难事。
关键是测活方法一定要先搞清楚，按照你说的，圈圈的方法，怎么定量？怎么确定酶活？
如果有好的测活方法，用native PAGE的方法也是可行的。
查查文献看别人怎么做的，分离纯化要活性测定方法先行。

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-12-23 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

wb做活性？你指的是免疫鉴定吧，没有抗体是比较麻烦。
乳酸菌不做wb能看出表达，说明你的蛋白很多了啊，表达量不低。
带tag没，有的话搞个亲和柱纯化点出来测活，应该不是难事。
关键是测活方法一定要先搞清楚，按照你说的，圈圈 ...

没有标签。。。
测活的方法至今只看到那个很粗的的办法，而且是适用于自己分泌出来的菌体的！泪奔了。

finger[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在网上找到以下资料：
《中国乳品工业》月刊
具有胆盐水解酶活力乳酸菌的筛选及16S rDNA分子生物学鉴定
所投刊社及刊社评论 | 作者个人资料
作者:董改香
摘要对分离自内蒙古地区牧民家庭自制的2份酸马奶中的9株乳酸菌，进行胆盐水解酶活力的研究。采用定性和定量两种方法，筛选具有胆盐水解酶活力菌株，并对筛选出的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定。结果表明：9株菌中只有菌株18-1-3有白色颗粒状沉淀生成，其余8株均没产生。游离胆酸的生成量和牛磺胆酸钠的消失量分别为0.8524mmol/L和0.8520 mmol/L。即游离胆酸钠的生成量和牛磺胆酸钠的消失量成比例。18-1-3菌株鉴定为发酵乳杆菌（Lb.fermentum）。
正文字体大小：大中小
(仅审稿人可阅)
对不起！您不能看到文章正文。
因为投稿人只允许所投刊社审稿人查阅此篇文章！
根据文章的内容，18-1-3菌株有白色沉淀且能水解牛磺胆酸钠，所以被鉴定为发酵乳杆菌。那么你的菌株能不能产生以上反应呢，如果不能是不是说转进去了也不能说是发酵乳杆菌呢。这是题外话。
你可以试试用上文提到的方法通过检测游离胆酸钠的生成量和牛磺胆酸钠的消失量来测定酶活力。希望这两种物质的检测方法比较容易实行。
把菌破壁吧，必须这样了吧
要是能定量检测生成的沉淀也是测定酶活力的好方向
提几个思路，仅供参考
祝顺

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 finger 于 2013-12-23 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

在网上找到以下资料：
《中国乳品工业》月刊
具有胆盐水解酶活力乳酸菌的筛选及16S rDNA分子生物学鉴定
所投刊社及刊社评论 | 作者个人资料
作者:董改香
摘要对分离自内蒙古地区牧民家庭自制的2份酸马奶中的9株乳酸 ...

如果我把菌破壁提出来蛋白，再和买来的牛磺胆酸钠反应可行吗？
谢谢你的祝福。
这几天失眠头痛都快疯了。

finger[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 qhyu 于 2013-12-23 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果我把菌破壁提出来蛋白，再和买来的牛磺胆酸钠反应可行吗？
谢谢你的祝福。
这几天失眠头痛都快疯了。

如果菌破壁后没有其它“夸大”或者“抑制”酶活力的物质，那么就不用提纯蛋白，直接用破壁后的菌液反应就行。测定好细胞浓度就间接定义了酶的浓度。
转进去了之后你试过与胆酸盐反应吗，有沉淀吗？
实验成不成功都能写论文，别太在意了
祝顺

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原帖由 finger 于 2013-12-23 17:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果菌破壁后没有其它“夸大”或者“抑制”酶活力的物质，那么就不用提纯蛋白，直接用破壁后的菌液反应就行。测定好细胞浓度就间接定义了酶的浓度。
转进去了之后你试过与胆酸盐反应吗，有沉淀吗？
实验成不成功都能写论文 ...

不成要怎么写啊。泪。。。
我看到一篇文献，里面提以测活的方法。
可是那是天然菌株。
我看了通篇，也不确定这种方法做的是胞内还是胞外。
不过有一个步骤是超声。
那应该就是胞外吧？？
如果胞内不需要超声吧？
Bile salt deconjugation ability, bile salt hydrolase activity and
cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains

xyw5[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同情，帮顶。
实验嘛，不要太在意，尽力了就好。
这东西做的是心态。
我们这边有句话，没有比不了业的硕士，没有考不上的博士，不要担心，呵呵……
再看看文献，找个靠的住的测活方法。
祝顺。

finger[使用道具]
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发表于 2013-12-23 17:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不成就写该基因片段在这个菌种内表达出的蛋白没有胆酸盐水解活性呗，也是防止别人走弯路，应该是有意义的吧。
超声破掉了细胞应该是胞内吧。
如果各种论文都没有很标准的测活性方法，那你就根据前文资料自己确立一个。做的好你的方法会成为流行标准哦，要相信自己
祝顺

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小中大

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原帖由 finger 于 2013-12-23 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不成就写该基因片段在这个菌种内表达出的蛋白没有胆酸盐水解活性呗，也是防止别人走弯路，应该是有意义的吧。
超声破掉了细胞应该是胞内吧。
如果各种论文都没有很标准的测活性方法，那你就根据前文资料自己确立一个。做的 ...

谢谢你的安慰和建议，主要是。。我们要求发英文的说。。。

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