【求助】蛋白质冻干前的buffer选择

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标题:【求助】蛋白质冻干前的buffer选择

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位好。我的蛋白在冻干前是溶解在20mM的乙酸乙酸钠buffer里的。冻干时按说应该是只有水分挥发吧，冻干后的固体是不是就是蛋白和盐呢，这样我是不是应该用水而不是buffer去溶解他呢，有点困惑，谢谢大家。

bling[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

只要不是挥发性的物质，冻干时时不会挥发的。冻干时最好加一些能生成骨架物质，比如甘露醇什么的，这样可以使冻干品有一个好的外形且有助于冻干过程的顺利进行，只用水的话会使冻干后的物品萎缩，水分不容易挥发且复溶困难

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说醋酸体系冻干的时候会挥发的，不会有盐

yychen[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道你的样品是用来做什么的，一般需要保存的蛋白质样品在冻干之前都先进过反相脱盐处理。

yychen[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 vvmmoy 于 2013-12-23 21:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你说醋酸体系冻干的时候会挥发的，不会有盐

醋酸盐不会挥发吧，就算醋酸挥发留下的还有NaOH啊！

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家的热心帮助。公布我的后续实验吧。今天把我的蛋白样品，在20mM乙酸乙酸钠体系里冻干，过程一切正常，用水（加了5%甘油）复溶也很顺利，没有不溶物。但是用此样品测了蛋白浓度以后去跑电泳（5ug蛋白），一加入loading buffer立即产生很多沉淀，沸水煮5min后完全形成沉淀，提示盐浓度超高。说明体系里确实是仅有水分挥发，大量的盐还是残留在体系里。
查了一下Amersham里面讲离子交换的handbook，如果后续操作需要冻干的话，建议采用挥发性的buffer，他提供的选择挺多的，除了考虑pH外，常用的酸碱有蚁酸，碳酸，氨水，碳酸氨等各种组合。有需要的战友可以pm我。

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发表于 2013-12-23 21:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yychen 于 2013-12-23 21:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道你的样品是用来做什么的，一般需要保存的蛋白质样品在冻干之前都先进过反相脱盐处理。

不知道您说的反相脱盐是不是就是常用的desalting的方法，但是一般的蛋白在纯水的环境下不是很容易变性失活么。

yychen[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

反相脱盐利用的原理是蛋白质的极性，蛋白质的疏水作用使得其很容易与非极性的反相物质结合，比如我们用的C18的反相柱，而极性的盐在冲水的过程中先洗脱下来，然后用易挥发的乙腈等去竞争性洗脱蛋白质，冻干后就只有蛋白质成分了。反相脱盐用的是加了0.1%TFA的水，不会造成很大影响。

skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yychen 于 2013-12-23 21:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

反相脱盐利用的原理是蛋白质的极性，蛋白质的疏水作用使得其很容易与非极性的反相物质结合，比如我们用的C18的反相柱，而极性的盐在冲水的过程中先洗脱下来，然后用易挥发的乙腈等去竞争性洗脱蛋白质，冻干后就只有蛋白质成分 ...

反相的原理不错。
但反相柱做纯化还是有风险的。
蛋白质在有机溶剂当中有些很容易失去活性，且常常不可逆。
0.1%TFA是较强的酸性，在低pH环境下，有些重组蛋白也很容易沉淀。
所以，我认为脱盐的话，小体积样品用Sephadex G25柱，中体积样品用透析，大体积样品用超滤是较好的选择。

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-12-23 21:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我经过一系列纯化后是用Amersham的脱盐柱（desalting）脱盐的，这个没有什么问题。主要是这一步的脱盐后的蛋白保存在什么buffer里面，不敢用纯水，担心蛋白会变性。用buffer又担心后步的冻干过程中盐也会被浓缩。查了一下，用挥发性的buffer是不错的选择。