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标题:【求助】为什么P-AKT 跑不出来，P-ERK等同...

coolcool[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么P-AKT 跑不出来，P-ERK等同...

同一蛋白
同一膜
条带大的GRP78和条带小的P-ERK 都很好
就是P-AKT 跑不出来
反复好几次
换了蛋白和抗体都不行
大家知道为什么吗
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

磷酸化蛋白提取液你是自己配的还是买的试剂盒？如果自己配加NaF时用什么来溶解NaF？
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

P-AKT的表达量要比P-ERK弱的多。
所以要增加上样量。基本上要增加2-3倍才可以。
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coolcool[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我会增大上样量试试，如果成功，来汇报大家
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tie8[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
磷酸化蛋白提取液你是自己配的还是买的试剂盒？如果自己配加NaF时用什么来溶解NaF？

========================================================

我也有同样的遗憾，请问自己买回来的这些东西是怎样配置的？谢谢
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大白菜[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

p-erk能杂出来，p-akt就一定能起来？
首先在不同的细胞里，不是所有的通路都存在的。
还有就是有些磷酸化是持续的，而有的是几个小时瞬间的脉冲
最后就是p-akt有473和308两个位点，你说的是哪个？如果想否定体系
最好加入阳性对照。如抗体说明书里的阳性蛋白。
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发表于 2013-12-23 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果用CST的p-akt（473）抗体，1：5000都是比较容易做出来的。用Insulin肌肉细胞C2C12就可以作为阳性对照。如果用组织做的话杂带比较多，细胞中则是单一条带，60k左右。Akt的表达量不小，我一般一个12孔板中的一个孔的细胞能做6次以上。用5%脱脂牛奶/TBST封闭1h。一抗四度过夜摇动。祝成功！
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发表于 2013-12-23 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们做的是乳腺癌细胞，取了0-24h不同时间段，都没有条带。
磷酸化酶抑制剂是上海生工的
抗体位点是473的
一直只有淡淡的影子，图不能用
我们换了CST、SANTA、minipore 的抗体
没多大用
但是阳性对照是有条带的
说明还是提取的蛋白有问题？
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发表于 2013-12-23 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能磷酸酶抑制剂有问题
我做磷酸化蛋白很多，没有出现过向你这样的情况
我用过CST的p-akt抗体
效果还是很好的
祝你顺利
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#问号#[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阳性对照有band那重新做lysate再试试，total-akt有没有做出来？
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