蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】酶切 困惑

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】酶切 困惑

=菓子=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71218
精华 0
积分 298
帖子 296
信誉分 100
可用分 2311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
1

发表于 2013-12-23 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酶切 困惑


我将pET28a-目的基因转化到DH5a中，长出单菌落后摇菌提质粒，酶切验证，第一次酶切后隐约有目的基因的条带（150bp），再次酶切后目的基因的条带竟然跑到300多bp处，很奇怪，大家帮我分析分析是什么原因？我是用EcoRI和SalI切的。很痛苦，我是不是没必要急着测序验证，应该重新连一次，转一次？先谢谢大家了！


查看积分策略说明
附件
2013-12-23 22:32
32907435.jpg (21.57 KB)
 
顶部
=菓子=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71218
精华 0
积分 298
帖子 296
信誉分 100
可用分 2311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
2

发表于 2013-12-23 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第二次酶切


查看积分策略说明
附件
2013-12-23 22:32
60713747.jpg (26.85 KB)
 
顶部
panda王[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72140
精华 0
积分 852
帖子 1444
信誉分 100
可用分 7919
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
3

发表于 2013-12-23 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的目的基因比较小，双酶切后的目的条带在紫外灯下是不易看到的。建议你在EcoRI和SalI之间选择一个合适的酶切位点做单切，如果没切开，就证明你的目的基因已连入载体，并且同时做个PCR鉴定，进行验证！然后就可以测序了。望实验顺利！！！！！
顶部
=菓子=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71218
精华 0
积分 298
帖子 296
信誉分 100
可用分 2311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
4

发表于 2013-12-23 22:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为当时没有设计引物，所以就没有做PCR验证，只能酶切验证和测序验证，这样是麻烦了点。从第二张图上来看，是不是我的目的基因自连了然后又与质粒相连，所以才位置靠后呢？
顶部
XYZQ[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74654
精华 0
积分 533
帖子 725
信誉分 100
可用分 4481
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-13
状态 离线
5

发表于 2013-12-23 22:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我的目的片段104bp和140bp，双酶切1-5h都只有上边一条带，没有目的带，这是怎么回事啊
酶切体系：质粒6μ，酶各0.5μ，buffer1μ，水2μ，
还有我PCR鉴定时在目的带附近又出现了一条带，目的带上方和它距离很近，这是什么原因造成的？
顶部
panda王[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72140
精华 0
积分 852
帖子 1444
信誉分 100
可用分 7919
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态 离线
6

发表于 2013-12-23 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的PCR鉴定出了目的条带，应该就是连入载体了，上方的条带是非特异性扩增产物！酶切鉴定条带看不到是正常的！
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
7

发表于 2013-12-23 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的图上看 应该没有切开，原因：1. 建议酶切时间12小时
2.建议换一个酶试一下
3.看一下NCBI上中国人的数据
4.你用的样本量太少，建议切24个以上，看是否有多态性
5.酶的用量不是太大问题，建议用0.3UL
6.建议设计引物时，片段控制在500bp以内
顶部
=菓子=[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71218
精华 0
积分 298
帖子 296
信誉分 100
可用分 2311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
8

发表于 2013-12-23 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的问题已解决：就是提的质粒浓度太小，目的基因的碱基数又比较小，故跑电泳看不出来，加大浓度后可以解决！
顶部