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标题:【求助】磷酸化的P38的Western

天蝎座[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】磷酸化的P38的Western


磷酸化蛋白的Western的条件和一般蛋白的检测在封闭等方面有差异，但是不甚明了。请大侠具体说下
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发表于 2013-12-23 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没差别，封闭这一步本来就没什么标准。大家应该都有自己的习惯，对结果没太大影响。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还是有差别的，磷酸化蛋白的Western要求封闭试剂本身不能含有磷酸化氨基酸。比如检测酪氨酸磷酸化时就不要用脱脂奶粉作封闭剂，因为脱脂奶粉含有磷酸化酪氨酸，用来作封闭试剂导致抗体与奶粉结合，使目标蛋白的磷酸化无法检出。这方面我们实验室就有过惨痛教训。
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发表于 2013-12-23 22:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xingyi08 于 2013-12-23 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还是有差别的，磷酸化蛋白的Western要求封闭试剂本身不能含有磷酸化氨基酸。比如检测酪氨酸磷酸化时就不要用脱脂奶粉作封闭剂，因为脱脂奶粉含有磷酸化酪氨酸，用来作封闭试剂导致抗体与奶粉结合，使目标蛋白的磷酸化无法检 ...


学习了，其他氨基酸呢？丝氨酸等，有没有影响？
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发表于 2013-12-23 22:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
希望能交流，我也做这方面的，我是用santa的一抗，请问你的一抗是
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红茶可乐[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关注关注！！！
我最近在做磷酸化蛋白，一直没什么结果，内参都做出很多次了，但传说中的磷酸化蛋白还没露过面呢!
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们最近也在做磷酸化蛋白，同学建议用BSA做封闭剂试试。
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

咨询一下，做磷酸化蛋白western 直接用磷酸化抗体，还是用普通抗体和磷酸化酪氨酸呢，两者有什么区别，哪种更容易做些。
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小螺号[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你做的是磷酸化丝氨酸或苏氨酸，都可以直接买thr/ser磷酸化抗体（zymed公司），我以前做过，在封闭的时候只能用BSA，而不能用脱脂奶粉。如果你做的时磷酸化酪氨酸，也有专么的磷酸化酪氨酸抗体。如果磷酸化杂交出来结果，检测出来的是磷酸化的蛋白，同时需要做一个普通目的蛋白的杂交，杂交出来是两条代，上面是磷酸化的蛋白，下面是未发生磷酸化的蛋白，可以根据蛋白条带确定目的蛋白的磷酸化程度。
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-12-23 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

咨询一下，AP标记的抗体和辣根过氧化酶的抗体在选择上有什么不同？
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