小中大平衡:用5~10CV的平衡缓冲液(Buffer A,如20 mM PB, pH7.0,具体的缓冲体系应根据目标蛋白的稳定性和等电点、离子交换介质的种类进行筛选和优化)以2-5ml/min的流速平衡层析柱,至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。
进料:样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制;低浓度样品溶液可用平衡液透析或添加相应量的盐;高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤(0.45μm)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
淋洗:以2-5ml/min的流速上样,并继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱:用洗脱缓冲液(20 mM PB+1M NaCl, pH7.0,也可采用pH梯度洗脱)以2-5ml/min的流速洗脱(可采用线性梯度洗脱或阶越梯度洗脱),收集流出液。
再生:每次层析之后可用1-2M NaCl清洗层析柱,除去强结合的蛋白。
原位清洗:介质使用数次(具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关)后,需要对介质进行在位清洗:
(1)对于通过离子键强结合的蛋白,可用2M NaCl以1-2ml/min的流速反向清洗10-15min; (2)对沉淀蛋白、疏水性结合的蛋白、脂蛋白,可用1M NaOH以1-2ml/min的流速反向冲洗3~4CV; (3)对强疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质,可用70%乙醇或30%异丙醇以1-2ml/min的流速反向冲洗3~4CV(使用高浓度的有机溶剂时,为了避免产生气泡,应采用逐步增加有机溶剂浓度的方法)。