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标题:【求助】蛋白无法表达换什么载体比较好

okhaha[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白无法表达换什么载体比较好


我用的是pet32a/bl21表达系统表达一个500bp左右的与细菌毒力相关的外膜蛋白,pcr鉴定amp平板上的克隆子为阳性,质粒测序也正确,IPTG诱导后在sds-page上与pet32a菌的对照相比无明显的表达条带,请问改换什么菌或者质粒比较好?
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你换pet22b试试吧，或者换宿主bl21plyss
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

与细菌毒力相关的外膜蛋白，这就决定了你这个蛋白很有可能是不好表达的。
你是否可以把表达的基因稍作改造，比如去掉跨膜区等，这样会有利于你的表达的。
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 68943512yao 于 2013-12-25 15:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

与细菌毒力相关的外膜蛋白，这就决定了你这个蛋白很有可能是不好表达的。
你是否可以把表达的基因稍作改造，比如去掉跨膜区等，这样会有利于你的表达的。 ...

做个western鉴定下有没表达吧。。。
一般膜蛋白的表达量仅为mg/L级别 SDS-PAGE基本上是看不到的。。。
如果是膜蛋白毒性导致表达量低 推荐
1、抗毒性蛋白宿主 C41（DE3）、C43（DE3）系列载体
2、体外表达系统。现在膜蛋白越来越多采用体外翻译了。一般体外表达体系都是针对T7启动子的，pET32表达效果还是不错的（我们实验室确定过）。Roche RTS最好，但借个最贵。Promega的TNT体系也不错，价格便宜，但表达量差一点。
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发表于 2013-12-25 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

继续摸索一些条件吧，我摸索了一些条件之后，表达量还是很不错的
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

C41（DE3）、C43（DE3）号称不错。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
外膜蛋白的表达，有两个策略
一个是表达成inclusion body，如果外膜蛋白不是很大（< 50k）的话一般复性成功率比较高。如果表达成IB？去掉信号肽即可。优点是表达量高，缺点是需要摸索复性。
第二个是表达全长。一般要用到上面战友提到的western。这时如果要加tag的话一定要在C端，否则会被剪掉。
表达全长的时候有的用OmpA的信号肽，因为这个剪切，表达都比较好。
如果表达全长而不想用tag纯化，要注意选择一些外膜蛋白缺失的突变菌株（具体名字忘记了，有兴趣请再跟帖）
表达载体一般选严禁控制的，比如pBAD，用很低浓度（低达0.006%乳糖诱导）
也有利用pET的leaky表达的。如果运气好，IPTG诱导也能得到较多蛋白。
另外，pET32 a应该是配合BL21 DE3使用的而不是BL21，希望你用的菌株是对的。
Have fun！
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-12-25 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.建议使用pSUMO 载体，SUMOtag比较大，融合形式的蛋白，可能较大程度抑制目的蛋白活性，纯化完毕后可以去除SUMOtag得到活性蛋白。
我们已经有成功案例。
2. 优化密码字是否可以做成包涵体表达？
3. 使用cell free系统
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发表于 2013-12-25 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2013-12-25 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
外膜蛋白的表达，有两个策略
一个是表达成inclusion body，如果外膜蛋白不是很大（< 50k）的话一般复性成功率比较高。如果表达成IB？去掉信号肽即可。优点是表达量高，缺点是需要摸索复性。
第二个是表达全长。一般要用到上面战 ...

pBAD可以用0.00002%的L-arabinose诱导。
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okhaha[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 flower-201 于 2013-12-25 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
外膜蛋白的表达，有两个策略
一个是表达成inclusion body，如果外膜蛋白不是很大（< 50k）的话一般复性成功率比较高。如果表达成IB？去掉信号肽即可。优点是表达量高，缺点是需要摸索复性。
第二个是表达全长。一般要用到上面战 ...

菌株是对的,de3,基因序列看过了,没有稀有密码子,谢谢各位的意见
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