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标题:【求助】请各位高人帮忙分析

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-25 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请各位高人帮忙分析

本人新手，初次做２D，如图，请各们帮忙分析一下，不胜感激。
样品：肌肉
GE18cm 3～10NL, 上样：150μg
IEF:
S1:250V　slow 30min
S2：1000V　rapid 2h
S3：8000V　liner 5h
S4: 8000V rapid 60000VHr
SDS-PAGE:
90V 30min
150V 至溴酚蓝跑出为止。
我想知道：1.点少的原因，第二向的电压是不是太小了。　
　　　　　2.第一向是不是聚焦不充分呀，因为时间不凑巧，这次只到50000Vhr左右。
　　　　　3.第一向电压和时间合不合理。
　　　　　
请各位多多点评。谢谢。


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2013-12-25 17:47
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发表于 2013-12-25 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说句实话，肌肉样品由于组分叫复杂，跑出比较漂亮的2-D图的确很困难，首先还是蛋白提取问题，个人觉得楼主蛋白提取方法可能有点问题，要详细介绍一下的提取过程，才好给出判断，至于聚焦同样样品处理有关，不过肌肉样品还是比较好聚焦的，能顺利升到8000V或10000V，18cm的胶条聚焦应至少在65000VH，另外建议楼主不要用3-10线性或非线性的胶条，这两种图谱很难跑好，直接用4-7或5-8的胶条，事实上好多发的肌肉相关的蛋白质组学文章都是4-7或5-8的！！祝楼主好运！！！！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-25 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，本人所用的蛋白提取是常规的提取方法，即组织裂解液（7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，5mM PMSF,1%DTT）1ml,加入研磨后的肌肉粉末约50mg.由于本实验室没有高速离心机，本人采用普通离心机，12000rpm，60min,15℃。之后上清分装。
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发表于 2013-12-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1裂解液中的各种试剂最好用进口的
2可以考虑加一步超声波破碎，效果会好些的
3离心前要室温静置1-2h,该过程中，可以隔10min振荡混匀30s左右
412000rpm的离心力有些小，至少要15000rpm，设在4℃
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-12-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢。除了你说的第四项以外，其他三项都是这样做的，超声功率为200W，超声时间5～7秒，间隔5～7秒，12次。然后就是放置约半小时，因为超声前放置了半个小时左右，我想，超声主要是为了除核酸，功率太大的话，会对蛋白有影响。也考虑过加核酸酶，但发现那个核酸酶不耐受高浓度的尿素等。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-12-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

点数量还可以或者略少一点点，少是因为那几个大点占得比例多造成的。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-12-25 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位的建议。
我现在感觉是因为第二向电压太低造成的，因为随着电泳时间的不断持续，电阻越来越大，其电流越来越小，这样，蛋白质的迁移速率也就越来越小。
我现在想按稳定电流来跑，即20mA～30mA，而不按稳定电压来跑，不知此法可行与否。
期待各位的指导。
今天就跑，明天出结果。
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发表于 2013-12-25 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天跑的，没有按稳定电流跑，只是把第二向电压加大，不过，电流还是在20～30mA，图如下，请各位高手帮忙找一个原因，其他的还是如上面的。
我向一位师兄请教过，他说可能是由于平衡的时候，DTT没有去除干净，碘乙酰胺失效，以致于造成拖尾现象。
大家帮忙分析一下，一向聚焦是不是有问题。
我感觉，一向聚焦好像还可以，不知道这种想法对不对。
谢谢。


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yueban-1147[使用道具]
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 小中大

去看看proteomics上的图片，印象中也就比你这个强一点了。好文章要的是好idea，而不是好图像
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 小中大

感觉你的样品处理还是有问题，另外二向似乎跑不动，可能是电泳缓冲液的问题，电泳缓冲液要注意更换，顶多用3次，或者平衡出了问题，平衡时在摇床上胶条要保持晃动，两个10分钟就可以了。其实，肌肉样的3-10的胶条跑的效果一般都不理想，再改进，也只会比上张图稍强些！！还是建议用4-7或5-8的胶条！！
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