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标题:【讨论】tris-hcl 在使用中的有趣问题

docsy[使用道具]
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【讨论】tris-hcl 在使用中的有趣问题


近日用deae胶 tris-hcl缓冲体系进行纯化,发现一有趣问题。
9.0ph的缓冲液,无nacl ,在开始进行柱子平衡时,流入柱子的必然是9.0ph的平衡液,然额流出的却是ph在6的液体,随着平衡液量的增加,流出液体的ph逐渐升高至7 再往后我就撤离实验室过来写帖子了,弱离子交换胶 deae结合0h-根的能力很强,所以流出液体呈现为酸性,是这样的么?
这样的话,如果按照柱体积的一定倍数进行平衡 岂不是说柱子里头的ph未必就是平衡液的ph? 在体积不够的时候,真要悲剧了
在缓冲液中增加nacl据说可以缓和这种情况,因为cl离子可以对冲oh-离子 真的假的,大家怎么看?
还有人说tris-hcl可以高压灭菌,那hcl不都挥发了,如果灭菌后再调ph 怎样保证无菌呢?
一个小缓冲液有这么多问题,真够有意思了,期待大家都讨论!
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docsy[使用道具]
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ps: 使用tris-hcl 洗了20倍的柱体积后,得到的ph依然只是7!
9.0的ph进去平衡柱子,死活只能平衡到7?
期待高人的解答
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yjf1026[使用道具]
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是个好问题。
这个现象在离子交换实际操作中一直是存在的,包括阴离子的DEAE、Q和阳离子的CM、SP。
但没有那本书中详细的讲过这个问题,只是说要充分平衡。
不仅是平衡时的pH,而且在用盐洗脱时也常常伴随着pH的波动。
我也思考过,不能完全解释。
觉得这些pH的变换至少和缓冲液的电离平衡、凝胶配基的电离平衡、溶液的扩散作用、pH计检测时的盐离子效应、蛋白质的两性等等相关。因素较多,想不过来了。
例如:Q柱在用NaCl、NaOH溶液再生处理后,用pH7.5中性的缓冲液去平衡,其pH曲线是先缓慢下降,然后快速下降至平衡缓冲液的pH7.5以下,或许是pH6.5,然后再慢慢回升到pH7.5,完成柱的平衡过程。
在用盐洗脱蛋白质时有一个pH挖坑的过程,先下降,回升超过缓冲液pH,再缓慢回复到正常。
据我的经验,长时间的平衡液洗柱,平衡肯定是可以达到的。一般强的Q、SP柱平衡要快些,弱的DEAE、CM要慢些。对常使用的20mM浓度的平衡缓冲液,Q、SP柱一般使用8-10个柱体积左右就差不多了。
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docsy[使用道具]
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我的经验,长时间的平衡液洗柱,平衡肯定是可以达到的。一般强的Q、SP柱平衡要快些,弱的DEAE、CM要慢些。对常使用的20mM浓度的平衡缓冲液,Q、SP柱一般使用8-10个柱体积左右就差不多了。
各位是否尝试过在平衡液里加一点 nacl做对冲呢? deae得到oh-的并失去cl-的时候,给平衡液加一些cl-以减慢cl-失去的速度并且使之更快达到平衡。
这时新问题出现了,如果平衡液是弱盐,比如0.05m nacl 洗脱液是 0.1m acl 是否有较大影响?
其实这一问题只要检测下有目标的流川就好了,完全不是个事,写出来 大家分享下
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yjf1026[使用道具]
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你用的是多大浓度的Tris呢?Tris在pH9.0的时候缓冲能力已经很差了,除非Tris的浓度比较高。而且你用的是弱阴离子柱,需要更长的时间才能达到平衡。
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(CH3)2 H·OH- +Cl---- (CH3)2 HCl+OH-,这是DEAE填料的平衡原理,如果没有NaCl的话,平衡靠得是Tris-HCl的缓冲能力,也就是说他们要不断的向碱性方向解离,才能平衡,所以时间有点长,而有少量NaCl存在的情况下,Cl很大程度上上缓解了缓冲液的解离压力,因此平衡时间会比较短,一般情况下5--8个柱体积基本能将填料平衡,而上面你说的流穿一直是7,我觉得可能是你的缓冲液有问题,tris应用的pH最好在8左右,9有点高,因为填料的平衡是一个正方向和负方向同时进行的可逆反应,哪个方向强度大,就是我们表观上看到显示哪个方向的pH
思路有点乱,仅供参考
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我使用的是0.05m的tris 根据常用化学液体配置表配置,ph9.0
老师建议我测下所配置平衡液的ph,明天测下再给大家汇报
已经计划加nacl测试了,因为原来的操作方法是一位 神仙级别的大师留下的方法,所以目前在尽力复制其的操作,期待我们得到的东西相同吧
ps:终于有高人坐不住出来了,期待大家继续讨论。感谢大家的热情帮助
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yjf1026[使用道具]
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我认为加NaCl平衡不值得,除非你的离子交换柱的起始buffer中就含NaCl。否则用含NaCl的buffer平衡好pH后,又要用不含Nacl的buffer去平衡电导,再这个过程中柱的pH还会有变化。
要平衡快些,可以先用高浓度的平衡buffer冲洗,再用实际用的buffer平衡。
如我们在用NaOH洗柱后,如果要平衡至pH8.0,20mM Tris-HCl,就先用pH8.0,1M Tris-HCl上个10ml。
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