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标题:【求助】Ni 柱挂不上去

langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Ni 柱挂不上去


我的一个凝集素基因测序正确,诱导后有大量表达,用活性和变型的方法挂Ni柱,均纯化不出来,而同样的试剂和柱子别人能纯化出来,真不知道是什么原因,郁闷死了.
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个有很多原因哈！
1、确定表达是你的蛋白
2、破碎情况
3、buffer 的PH值 这个很重要
4、binding buffer、Washing buffer、 Elution buffer 的咪唑浓度！
5、有可能没有平衡好柱子，蛋白没有挂柱
6、 Washing buffer 咪唑浓度太高，目的蛋白和杂蛋白一起被洗掉了
你最好能在纯化过程中，检测紫外，看看纯化情况，具体问题具体分析，蛋白很复杂的!
还有问题，希望我们可以交流，现在我正在做用AKTA purifier100 纯化带6个his的蛋白
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
带标签的蛋白不结合镍柱是常见的，你的目标是拿到纯的蛋白质,不是让他一定跟镍柱结合.
所以:
1) 尽可能的验证表达的蛋白质是你的目标蛋白
2) 用其他手段纯化,只要你的目标蛋白质纯度够你用就可以了，未必拘泥于是什么方法纯化的.
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langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上两位战友！因为我要测它的活性，而且破碎后有活性状态的蛋白，所以想用非变性的方法回收。现在用变性方法也回收不出来，不知用割胶的方法回收的蛋白还能不能复性，
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你表达好的蛋白质有活性,重新变性再复性是不合理的做法,除非万不得以.
有很多其他的方法可以把你的目标蛋白质分离出来，如离子交换\疏水\分子筛.
总之, 在决定变性/复性的方案之前,尽可能用其他方法.因为变性后复性的难度比较大.
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上说得很对，本来有活性的东西不应该再去变性了。
“而同样的试剂和柱子别人能纯化出来”，别人能纯化得出来的是和你同样的蛋白吗？
而且你可以尝试其他方式的纯化方法的，一种蛋白质的纯化可以有很多种方法，只要能达到目的的就是好方法。
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发表于 2013-12-27 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重新用变性的方法做了一下，把洗脱液全跑了电泳，发现所有的洗脱液中都没有目的蛋白，说明蛋白挂上去后，洗脱不下来。以前破碎后发现上清和沉淀中都有，现在怎么做上清中都没有了，我都崩溃了，唉
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你表达是包涵体吗？你可以诱导到上清哈！低温慢速过夜，这是我们实验室常用的，但IPTG加入量好减少！
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langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你们是多少度诱导啊，我也试试
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-12-27 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是呀，我的蛋白表达诱导后也总是在沉淀中，我试过20度诱导3小时，可是还是在沉淀，不是楼上指的低温慢速过夜具体是什么？IPTG加的量是多少？
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