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标题:【求助】超声波破碎细菌+Triton-X-100

chengjie79[使用道具]
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发表于 2013-12-28 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超声波破碎细菌+Triton-X-100


原核表达后超声波破碎细菌提取重组蛋白，网上很多帖子都说用含有1%的
triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，可是我在超声时加入triton后不一会就出现大量泡沫，最终导致破碎不完全，超声仪器感觉也很费劲，声音都几乎听不见了，是我哪里做得不对，但是重复了两次都是感觉加triton有问题。不解，请各位指点。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2013-12-28 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有人说是探头位置的问题，但是我感觉不是，只要不加triton泡沫就会好很多。
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发表于 2013-12-28 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
triton是一种表面活性剂，或多或少会对产生泡沫有一定的贡献。
你只是做原核表达，E. coli超声破碎很容易的啊，没有必要加triton的。
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发表于 2013-12-28 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果不是蛋白实在溶解不好，没必要加.
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am10[使用道具]
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发表于 2013-12-28 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我又想起一点，你加表面活性剂，是不是你表达的是膜蛋白？？
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2013-12-28 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我表达的不是膜蛋白，但是重组蛋白可溶部分很少，大部分是包涵体，ni-nta纯化后还要复性，我就怕复性不好后面没法做活性。试试吧！
尽管我不加triton，还是有些泡沫产生，是不是蛋白变性了啊! 我用的500W，超三秒，停三秒，共破12分钟，也就是120个循环。
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发表于 2013-12-28 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只要是有泡沫产生都意味着蛋白可能变性，建议你超3秒停6秒试一试，还有，破碎的时候盛放菌液的容器要放在冰水混合物中哦。
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-12-28 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我每次超声完离心后总是看见许多黑色的东西，有同学说是超的太厉害了，是不是这回事，我们那个老式超声波只能调节振幅、时间、超声间隔时间三个条件，我的条件振幅75、时间2分钟，间隔时间5s。这个时间我感觉就很短了，可每次还是有黑色沉淀。我的菌株是BL21,载体是PGEX-4YT-3,请问我怎么样才能摸索好超声条件？我用反复冻融法行不行？
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发表于 2013-12-28 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

天哪，怪不得。振幅降下来，调到30～35即可，黑色的东东是高温变性的蛋白啊。
你有没有一边冰浴一边超声啊？绝对不可以不冰浴的哦！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-28 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
振幅降一些，如果你超声破碎后的包涵体要上柱纯化的话，你可以用裂解Buffer（如Buffer B）代替Trion X-100,一来裂解Buffer本身就具有破碎菌体的作用，二来它不会影响你的蛋白挂柱，我平时就是这么做的，效果还不错。还有一种配方是：溶菌酶+Trion X-100，有了溶菌酶，Trion X-100的量就可以减少些，泡沫就不会那么夸张了，效果也可以。具体的超声破碎条件就要视你的蛋白特性而定了，一般超声时间与间隔时间相当就可以了，再有你可以降低强度或超声时间，延长总的破碎时间，对你的蛋白损害小一点。再有就是战友们都提到的了：冰浴破碎，切记
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