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标题:【求助】用10%的SDS-PAGE跑10KD的蛋白有什么后果

cj_mondy[使用道具]
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【求助】用10%的SDS-PAGE跑10KD的蛋白有什么后果

书上10KD的蛋白都推荐用15%-20%的胶,否则蛋白会分不开
我始终无法理解这个分不开是什么意思,按说我加了抗体只会出现我要的目的条带啊
因为试了几次都发现15%胶跑Marker10KD的带会很模糊,而10%分的很清楚,10KD 的带都很漂亮,那我不能用10%胶上的Marker为准吗?
菜鸟求解!
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wood533[使用道具]
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关于分不开:简单说来,不同浓度的SDS-PAGE凝胶有不同大小的孔径,而大浓度的胶(如15%)孔径小,10KDa的蛋白为何推荐用15%的胶是因为该浓度胶能较好地匹配该分子量,因为小分子量的蛋白在较小浓度的胶(如8%等)中不能被捕捉到。 针对你的问题,你选择10%的胶的孔径与分子量不够匹配,另外我们在做10%胶时10KDa的marker通常是不容易跑出来的,所以检测蛋白时还是应该根据分子量的大小选择合适浓度的胶.
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cj_mondy[使用道具]
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那为什么我用15%胶的时候反而10KD的带出不来呢,在10%时却能出来
不解啊
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cj_mondy[使用道具]
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难道是我电泳的条件不对?
我是用70/120V,一共跑了1h 40min,Marker还是挤在一起没怎么分开,10KD带很模糊成一片
是不是应该用低电压跑,时间久一点?那样会不会小分子量的蛋白弥散的更严重呢?
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wood533[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 cj_mondy 于 2013-12-28 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那为什么我用15%胶的时候反而10KD的带出不来呢,在10%时却能出来
不解啊

这是不正常的现象,检查一下你的电泳体系如电泳液,凝胶的配制等是否出现问题
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mamamiya[使用道具]
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关于你的问题,我给你详细说说吧,好多书都没有说明白,甚至好多所谓的主编自己都没有明白,好多的书都是为了评职称,水平低的很,建议楼主多看看权威的材料。
跑胶不管是蛋白胶还是dna胶其实都是一样的
原理是分子筛作用,条带大的受到的阻力大,小的相反,也就是小的跑的快,大的跑的慢,所以就分开了。
但是如果两片段相差很小,那么经过几厘米的分离胶后,他们之间的差距很小,用肉眼分不开,甚至小片段的尾部和大片段的头部混到一起,成了一条线
这时候就需要让他们跑的再久一些,理论上只要大小不一样他们就能分开
但是我们的电泳槽可没有那么大,而且随着跑胶时间的延长,条带还会弥散,所以通常我们所说的分开分不开的仅限于电泳槽里的胶长度。
所以当我们用同样长度的分离胶时,浓度大的胶里的阻力更大,相当于把浓度低的胶的长度压缩了,所以其分辨率就更高了。
至于你说的10kd,一条带哪来的分辨率?!正确的说法应该是相差多少多少kd,是书上写错了。
像你说的15%的分不开,10%的却很亮,可能有两种情况,
1,15%的跑的时间短
2,你把条带数错了
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cj_mondy[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2013-12-28 15:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

关于你的问题,我给你详细说说吧,好多书都没有说明白,甚至好多所谓的主编自己都没有明白,好多的书都是为了评职称,水平低的很,建议楼主多看看权威的材料。
跑胶不管是蛋白胶还是dna胶其实都是一样的
原理是分子筛作用,条带大 ...

条带数错了应该不会,因为最后一条10KD的带是绿色的,其他带都是蓝色的
因为每次跑到最后marker没跑开的原因可能是时间不够或电压不够大
但是下面的绿色的带却弥散成一片模糊了,看不出来是一条带了,这可怎么办?是不是说明10KD左右的蛋白也都已经弥散了?这样做出来的结果会不会也是模糊一片呢?
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cj_mondy[使用道具]
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胶和电泳液也是现配的,应该可以排除时间长了液体PH等变化的问题。
电泳仪用的是BIO-RAD的
10%的胶每条带都可以分的很清楚,包括那条绿色的10KD的带,我可以以这个为准吗?
因为15%的胶根本看不清10KD的带到底在什么位置
也有园友说小分子量蛋白要用低电压跑,可以低电压不是更容易造成弥散吗?
恳请索莱宝朋友指点一二。谢谢
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hold住[使用道具]
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10kd的是染料 菜鸟
不信你做一下WB
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cj_mondy[使用道具]
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10
 

我今天竟然在34KD的那条带那里染出来了,怎么回事,相差那么多
楼上战友说的10KD是染料我知道,不是代表10KD的蛋白所在的位置吗?
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