小中大【求助】蛋白变性纯化后的复性
情况如下：
基因工程发酵纯化一种38肽（cP），载体为pet32a，宿主菌为大肠杆菌BL21，目的蛋白为硫氧环蛋白-cP融合蛋白；测序证明碱基序列正确，小量发酵验证融合蛋白大小正确；问题及解决方法如下：
1.超声破菌，400W、3s/3s、40min，证明目的融合蛋白在破菌上清，但蛋白条带由1条变成了3 条，超声条件为80W、3s/3s、10min，菌悬液非常浑浊，电泳后依然为3条带，故认为蛋白被降解；
2.菌悬液用溶菌酶重悬后37℃水浴30min，取样电泳，蛋白条带有3条，即蛋白被降解；
注：1、2菌悬液中均加了1mM的PMSF、5mMEDTA、2mMβ巯基乙醇。
3.综上，决定采用变性纯化法，即先用含8M尿素的缓冲液充分重悬菌体，超声破菌，去上清及沉淀电泳，融合蛋白在破菌上清，1条带；
4.上清挂柱，6M-1M尿素复性缓冲液梯度洗柱，使蛋白复性，再用咪唑洗脱；
5.将含融合蛋白的洗脱液超滤，第一次加水即出现白色絮状沉淀；超滤不可行；
6.将含融合蛋白的洗脱液透析，1h内透析袋内液体浑浊，后液体逐渐澄清，但透析袋底部出现团块沉淀；
7.将透析袋内液体超滤；
8.电泳，样品有咪唑洗脱液、透析后超滤得溶液、透析后超滤滤出液、透析中形成的沉淀，发现透析后所得的液体基本上不含融合蛋白，沉淀是融合蛋白，但是沉淀凝聚成团，超声都打不碎，8M尿素也溶解不了；
9.取沉淀直接用蛋白酶酶切，取酶切溶液及剩余沉淀电泳，发现只有一少部分被切开而可溶，大部分仍然以沉淀形式存在。
亲爱滴们，我现在做纯化都半年了，急着拿到蛋白做活性呢，有没有什么高招传授传授？
