【求助】90kd 120kd 大分子蛋白转膜条件！

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标题:【求助】90kd 120kd 大分子蛋白转膜条件！

米西11米西[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做几个大分子蛋白，分别处于90kd，120kd，想和大家交流一下转膜的条件
我自己做的一些经验如下：
湿转：bio-rad湿转，恒流300mA 转2小时，也试过转3小时，以及用350mA转膜，自我感觉3小时的蛋白泳道比2小时的清晰
半干转：北京六一的半干，恒压20v转1小时和1.5小时，但基本蛋白泳道要么没有，要么有也不是很清晰
想和有经验的坛友们交流一下做大分子蛋白的条件
我这样的情况如何去改进，另外，我也很想摸索一下湿转和半干转的效果，想同时做，对比一下。请大家不吝赐教，谢谢！！！

idea2011[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，120kd不算大分子，转膜条件用最常用的就可以。
（科里做140kd的就用常用的，不难做）
1.湿转，恒压 140V 2.5h 条带都很不错
2.转3个小时蛋白转到膜的百分比多吧，所以清晰。
转膜时间可以摸索一下

米西11米西[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 idea2011 于 2014-1-7 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先，120kd不算大分子，转膜条件用最常用的就可以。
（科里做140kd的就用常用的，不难做）
1.湿转，恒压 140V 2.5h 条带都很不错
2.转3个小时蛋白转到膜的百分比多吧，所以清晰。
转膜时间可以摸索一下 ...

你的意思是说转膜后泳道的清晰程度并不能说明转膜的效果好坏，是吗？？

米西11米西[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有同志摸索过半干转的条件吗？

pencil菲[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这两个分子都不算大吧，常规一点的条件就可以了。
转好以后可以用考马斯亮蓝染一下胶，看看转移是否充分，立春红染一下膜也看看吧。
呵呵，说的都是常规的东西

eve_49[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是半干转膜，当时我做的是130kd的iNOS蛋白，一般半干转1小时就行了，如果不放心那就延长的1.5h，肯定没问题的。

米西11米西[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在转膜后基本问题不大，丽春红染都能看到清晰的蛋白泳道，抗体孵育显色后内参有，目的是白板，于是考虑可能二抗有问题，换了一种进口二抗，结果背景非常高，下一步降低二抗浓度试试

kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的蛋白分子量是94KD，我用半干转膜仪输入电压是220V输出电压是9V转两个小时，效果很好。你可以尝试一下。转膜时间不宜太长，也不要过短，你可以再摸索一下转膜时间。

米西11米西[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kuohao17 于 2014-1-7 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的蛋白分子量是94KD，我用半干转膜仪输入电压是220V输出电压是9V转两个小时，效果很好。你可以尝试一下。转膜时间不宜太长，也不要过短，你可以再摸索一下转膜时间。 ...

恩，多谢您的回答，给了我参考，之后多摸索一下半干转的条件，不能让仪器闲置啊，同时也摸索一下恒压和恒流的条件