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标题:【求助】蛋白形成二聚体怎么办

lorri[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白形成二聚体怎么办


我纯化了一种酶蛋白，分子量大小３６ＫＤa左右，SDS-PAGE电泳条带显示分子量确实为36KDa，用不加巯基乙醇的缓冲液处理样品，没有煮样品，进行SDS-page电泳，条带也为36KD.但是，我还对这种酶蛋白进行胶内酶活检测，确定这条蛋白带确实具有酶活，样品的处理方法是用不加巯基乙醇的缓冲液处理样品，没有煮样品，用荧光染料染色后，与蛋白MARker对比，有酶活的条带的分子量大小为72-75KDa左右，是只有二聚体有活性，但是我却无法解释这一现象，不知各位高人有什么好的方法和意见，请大家给我出一出主意，谢谢大家了
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发表于 2014-1-7 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很多蛋白质是二聚体或多聚体有活性, 是正常的.
如果你的酶活性比较高,则可能因为少量的二聚体在你的样品里,你检测到72kd附近有活性.
你的结果已经是判别性的了.
如果你还要进一步做下去,可以尝试把单体与二聚体分离开来,进一步研究
ps, 你的蛋白在SDS-PAGE中不需要进一步处理就有活性,不知是否有足够的文献证据? 一般这样的蛋白属于超级坚强的了.
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发表于 2014-1-7 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
首先，谢谢楼上对我的指点，非常感谢
你给我提出的解释和能说明问题，也是我感觉豁然开朗，不知你这种说法 又没有相应的文献作为依据，如果有麻烦您告诉我文章的名称和杂志，我论文中对一结果的解释很让我头疼。
不知怎样把二聚体与单体分开进行研究，我的专业是微生物，蛋白方面的知识还是比较少，请大家再指点一下。
补充一下，我的蛋白在跑完SDS-PAGE以后，通过Triton X-100进行蛋白复性过，活力还是有限亚。
我用不加巯基乙醇的缓冲液处理样品，没有煮样品，进行SDS-page电泳，用考马斯亮蓝G-250 染色，得到的条带为36kDa，也没有72Kda的条带存在。确实如你所说，如果有二聚体。一定是少量存在的。
我想再问一下，二聚体的形成据我所知，有通过二硫键形成和通过疏水作用形成两种方式，我了解到如果是通过二硫键形成二聚体，那么可以通过尿素作用可以将二硫键解聚。
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u76mp[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Urea是无法破坏二硫健的，Urea只能破坏疏水作用和氢键；
还原剂如DTT可以打开二硫健。
站内搜索一下，有很多相关的信息。
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发表于 2014-1-7 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚刚做了一次native-PAGE，因为没有非变性的Marker，所以就用SDS-PAGE的Marker代替了，跑出的蛋白条带要远远快于Marker，因此，也无法证明72Kda条带的存在。
关于我这种酶的文章共找到四篇，均为胶中36.5kDA蛋白条带有酶活性,这也是我这种酶与他们相区别所在，因此，如果我检测到蛋白胶中36.5kDA有酶活也就可以解释了，但是二聚体就欠缺实验证据和依据了，这种情况下，如果写文章的话，应该可以接受么？
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发表于 2014-1-7 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

类似的问题我也有，但是我的是单体有活性，蛋白总是聚集，非常郁闷现在卡在这里了~如何解决单体总是聚合成多聚体啊?另外咪唑浓度对这方面有影响吗？
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发表于 2014-1-7 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
类似的问题我也有，但是我的是单体有活性，蛋白总是聚集，非常郁闷现在卡在这里了~如何解决单体总是聚合成多聚体啊?另外咪唑浓度对这方面有影响吗？

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普通情况就是加0.5-1mM DTT,或者5-10mM β-ME就行了，注意PH要大于7效果才明显，上NI柱前一定要把游离的NI冲干净。
如果还聚，就需要控制浓度了，一般来说，浓度对聚合影响很大。
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发表于 2014-1-7 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑native-page 蛋白容易形成二聚体吗
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发表于 2014-1-7 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白是可溶性的，文献报道二聚体才有活性，可是我用不变性的方法镍柱纯化几次了都没纯化到目的蛋白，请各位指导
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白也是可溶性的，过的葡聚糖柱子，我们实验室有人也过镍柱没有洗脱到目的蛋白，原因很多，最重要的就是为什么组氨酸尾巴没挂上，重复一次试试，不行就改别的表达载体试试
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