【求助】求native-page的高手!

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标题:【求助】求native-page的高手!

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

鄙人最近做有一个碱性蛋白的native-page.改蛋白pI=9.26,我用的是酸性的电泳缓冲液(2-丙氨酸,和乙酸,pH=4.5),电压85,室温.跑完电泳之后,竟然什么条带都没.
希望有高手把native-page的优化操作赠送给鄙人!

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发表于 2014-1-7 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ffooll 于 2014-1-7 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

鄙人最近做有一个碱性蛋白的native-page.改蛋白pI=9.26,我用的是酸性的电泳缓冲液(2-丙氨酸,和乙酸,pH=4.5),电压85,室温.跑完电泳之后,竟然什么条带都没.
希望有高手把native-page的优化操作赠送给鄙人! ...

这个帖子中有答案《关于<非变性/native-PAGE及相关的蛋白回收>帖子总结. [精华] 》
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/1216805')

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发表于 2014-1-7 16:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在看完前辈给的这个网站后,依然不是很懂!
首先,我的蛋白的pI=9.26,
那么,按我的理解,我该选择的是如下电泳体系:
Native PAGE 分离碱性蛋白，要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）
堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）
电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂。
问题:
(1)实际操作过程中,我用的也是这个电泳体系.
只是,在配制胶的过程中,我并不是很理解（7.7% T，2.67% C）和（3.125% T，25% C）得意思,
而且,我按用的王家政的<蛋白质纯化手册>的做法做的.但是我不能理解的是1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）这样配置的贮存液竟然是40%,按我们实验室SDS-page是30%的,而且这个说法在好几个论坛上都是这样说的.我无法理解,这是不是以讹传讹.
(2)在配制电泳缓冲液的时候,发现的问题.
0.14M的 2-丙氨酸和0.35M的 Ac 加进去后,PH远远小于 4.5,而2-丙氨酸的PH正常的是6.5-7.5
在调PH 的时候我用的是--丙氨酸,很明显,这个调pH后2-丙氨酸的浓度明显改变了.
我想知道,是不是我在这步调pH弄错了?
(3)我想知道做过的人的上样缓冲液是怎么配置的.因为我配制的甲基绿上样液感觉在点样的时候有点外逸,沉积效果不是很明显.

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发表于 2014-1-7 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我没有做过native，看到楼主的问题我也反复翻看了王家政的《蛋白质技术手册》、郭尧君的《蛋白质电泳试验技术》以及园子里的一些帖子。我没有看明白，也没有找到楼主战友问题的所有答案。
有几个问题可以回答：
1、7.7% T，2.67% C和（3.125% T，25% C）的含义
T就是我们通常所说的胶浓度，如12%的胶，15%的胶等等
C是Bis在总丙烯酰胺中的比例，如我们所用的30%母液(Acr:Bis=29：1），它的C就是1/30=3.33%
你很有可能在这儿出错了，是按你实验室做SDS-PAGE的母液去配的？
但是我很怀疑资料中的这个25% C，按照书上的理解，25%C将不能成胶！所以我怀疑这是2.5%的排版错误。
2、按(Acr:Bis=29：1）配制100ml的母液肯定是30%的。
其它的我就回答不了了，也很期望有实际经验的战友来指导一下。

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发表于 2014-1-7 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恩,今天我反复搜罗了下站内,以前的贴.发现:
酸性非变性电泳工作液配制：
40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）
4×分离胶Buf(pH4.3,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH, 以HAc 调pH至4.3，Milli-Q定容至100ml。
4×堆积胶Buf(pH6.8,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH, 以HAc 调pH至6.8，Milli-Q定容至100ml。
5×电泳Buf（pH4.4,β-Ala-HCl）：35.64gβ-Ala，以HAc 调pH至4.4，dH2O定容至1L。
2×甲基绿上样Buf： 1ml 1×（pH4.4,β-Ala-HCl）电泳缓冲液，3ml甘油，1ml 0.4g/L甲基绿，5ml dH2O；-20℃贮存。
10％APS
0.25％考马斯亮蓝染色液：Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml
考马斯亮蓝脱色液：100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
电泳胶的配制及电泳条件（酸性电泳注意要反转电极，即上槽电极为正，下槽电极为负）：
酸性非变性胶　　　　17%分离胶(10 ml)　4%堆积胶(5 ml)
40%胶贮液(40%T,3.3%C）　　　　4.25ml 　　　0.5ml
4×分离胶Buf(pH4.3,0.24M KOH-HAc) 2.5ml 　　　　/
4×堆积胶Buf(pH6.8,0.24M KOH-HAc) 　/ 　　1.25ml
水　　　　　　　　　　　　3.15ml
10％APS　　　　　　　　　　 75ul
TEMED　　　　　　　　　　　 25ul
5×电泳Buf（pH4.4,β-Ala-HCl） 200ml稀释到1L
电泳条件：反转电极，100V恒压约15min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约60min。
染色和脱色：取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。
这个贴看起来很合理,刚在准备各种溶液.希望能做出来,希望关注这个贴的战友没,多多给点意见.
顺便问下,我把染色液的甲醇改乙醇是否可以!

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发表于 2014-1-7 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顺便问下,我把染色液的甲醇改乙醇是否可以!

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我们做SDS-PAGE时的染色液都是乙醇的，另外脱色就用水微波炉加热，不加任何东东。

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

恩.谢谢!
我们实验室做SDS-PAGE胶也是用乙醇的.但是,我看站内所有的贴,基本上都是甲醇,我也不敢乱改!

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发表于 2014-1-7 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用血清做对照跑native-page,跑不下去.但有条带,能说明我做的胶是好的吗?

ffooll[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哈哈,鄙人native-page获得突破:
并将心得告诉大家.
(1)首先,配方,当然一般不出问题的是碱性蛋白的胶.他的配方如本贴上面的配方.
(2)染色配方:1% 考马斯亮蓝 G-250 1g 溶于100ml 乙醇 100ml 乙酸 800ml 水
脱色液 100ml 乙醇 100ml 乙酸 800水.
(3)最省钱的检测制胶好坏的方法:
(声明:该方法是本人一次意外,不小心发现的.本人理解是可行的.如果给他们造成损失,一律不承担任何责任.)
用溶菌酶做为marker,因为溶菌酶是有活性的.该酶分子大小为(14.3kD-18kD之间),是碱性蛋白.并且有4个二硫键.跟我们检测的活性蛋白有一点点用处.
(4)贮存液用30%的丙烯酰胺也可以的.
OK. 希望这个贴给各位战友有点帮助.感谢tie8前辈对鄙人的帮助.