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标题:【求助】western blot的最大上样量

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发表于 2014-1-7 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot的最大上样量


目标蛋白表达量少,想上样达到最大,请问最多能上样多少ug,而且蛋白条带不会弥散,
有人说只能90ug,但是,我上样到90,依然条带很浅细,几乎照不出来.请大家指教
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发表于 2014-1-7 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想知道 我的目的蛋白也少 连内参都不出来
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人感觉没关系吧，你先多上点，即便一开始弥散也没关系啊，能做出来再说做的漂亮，你觉得呢？
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-1-7 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使用1.5mm厚的胶，最大上样体积可以达到50ul。通过浓缩蛋白溶液，我上到150ug，条带依然很清楚。建议先用胰酶将细胞消化下来，同时采用并组，多收集一些细胞，再加少量细胞裂解液，即可达到浓缩蛋白的目的，上样量亦可提高
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

According to some referances, proteins transfered to the membrane from the SDS-PAGE gel may be refolded at least partially. This may be part of the reason for the recognition of the Ab and Ag.
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量的最大量不是以质量来算的，是体积问题吧！关键是你的蛋白浓度，要想条带好看可能0.75比1.5的好,上样量的多少就要靠你的蛋白浓度了，一般1.5的胶最多上50—60ul的样，而且很容易就溢出来了反而影响结果，建议使用蛋白浓缩试剂盒浓缩样本。还有就是建议6X的sample buffer比2x的好。如果内参都出不来，真的是提取的蛋白有问题了，是不是蛋白提取液太多，组织/细胞太少！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的大侠，我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢
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发表于 2014-1-7 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量最大的问题，我个人理解是其实没有关系的，只要胶做的没有问题，你完全可以做一个浓度梯度的条件摸索的，比如100，150，170，200ug的上样量，哪个条带跑的有弥散了，就知道哪个是最大上样量了。我有时候上样量达到100条带弥散了，有时候又很好，所以个人觉得还是跟做的胶有一定的关系，还有就是空的泳道要加loading buffer填充才不会弥散。
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发表于 2014-1-7 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢 ”
我觉得可能是你内参的抗体问题，看看实验室其他人用相同的抗体有没有问题，要不就换个内参看看，不要耽误时间！
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用60微升的,效果不错。不过我建议你多收集样本，少加裂解液。
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