【求助】样品缓冲液裂解不了菌体!

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标题:【求助】样品缓冲液裂解不了菌体!

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正在做不连续SDS-PAGE检测pET系统的诱导表达产物。产物为四聚体酶蛋白，产出形式为包涵体（已确定）。检测时不经纯化，直接用未诱导菌体总蛋白与诱导后的菌体总蛋白对比进而检测。
凝胶缓冲液、Acr-Bis母液等凝胶配制的方案均遵从宝生物（Takara）公司商品宣传资料上的配方。唯独使用的2X上样缓冲液配方是用的我们学校自己编的生化实验指导上的配方（因为宝生物书上没有）。
具体配方为：
0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8, 与浓缩胶缓冲液pH相同) 2ml
甘油 2ml
20% SDS溶液 2ml
0.1%溴酚蓝溶液 0.5ml
2-beta-巯基乙醇 1.0ml
双蒸水 2.5ml
共10ml
样品裂解效果很不好：一毫升菌体离心去上清后加双蒸水，2X上样Buffer 各50微升，沸水浴3min后，13000X 离心3min，EP管底的沉淀和菌液首次离心去上清之后的菌丸大小基本没有任何区别，且颜色依旧为白色。凝胶染色完成后发现无论染多久条带都很浅，根本无法照相。
为改进实验，我先后试过增加沸水浴时间至5min甚至10min，离心转速不变但时间缩短为1min，或是改用40%SDS溶液配置，再或是加大巯基乙醇用量，以及再在上样缓冲液中加入尿素至终浓度为8mol/L，但始终没有任何起色。
难道这个上样Buffer根本不能用于菌体总蛋白的SDS-PAGE检测？恳求各位大侠指一条明路！！！

pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得是包涵体的原因吧，上样缓冲液不能溶解包涵体。你可以试试在样品处理时加些尿素，使包涵体复性。具体的我也没遇到过，等你的实验结果。

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

经过试验~~~~问题依旧~~~~~！
加了尿素，但是菌体还是没有解体。跑的SDS-PAGE还是浓度很低。

nn255[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、上样缓冲液的配方没有问题，但不知配制用的试剂有无问题。
2、电泳后染色marker表现怎么样，发个图片上来，用jpg格式，附件直接显示，标上marker分子量。
3、加上样缓冲液后有无混匀？沸煮后，样品有没有粘性？上样量是多少ul？电泳胶浓度？
4、一般菌体加了上样缓冲液沸煮后，再离心，深蓝色的样品中很难看清楚沉淀的多少，所以我估计你的问题很可能出在加上样缓冲液后没有混匀，或上样缓冲液试剂有问题。

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图我今天再诱导表达跑一次之后再传上来。但Marker始终跑得还算在正常范围内，叫应该不会有问题。
上样缓冲液配制所需的2-beta-巯基乙醇为新买的国产，（应该不会有问题）；
溴酚蓝，Tris，SDS均为进口试剂；
甘油为国产，淡应该不会有什么问题吧？
每次加完上样Buffer后用涡旋振荡器混匀了的，煮沸后粘性不大，点样时样品的沉坠感不强（感觉就像甘油加少了一样）。后来试过加大甘油用量，沉坠感倒是加大了，但是条带依然很淡。
上样量原先为20微升，后来因为条带淡的原因就加大为30，40（满孔），但条带的颜色始终很淡，没有任何起色。凝胶浓度10%，12.5%都试过，亚基分子量大约为60Kd。
按照前述配方配制出的SB问题就在于颜色很淡，几乎为天蓝色。所以离心后沉淀量和沉淀颜色都看得一清二楚。用其他跑出来过的同学的溴酚蓝溶液配过SB，颜色还是天蓝。所以猜测问题应该不在溴酚蓝。
现在就在怀疑可能是配方出了问题。各位一般用的是什么配方呢？

nn255[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的配方与分子克隆上的一样，只不过加为5×，为了低浓度蛋白上样量更大一些。
1×的配方如下，5×的你要自己计算一下，我手头没有。

附件

2014-1-7 17:12

80224254.jpg (22.11 KB)

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有没有谁也做过不连续SDS-PAGE检测菌体诱导表达的啊？你们用的是什么配方呢？

guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上一个这周跑的：左边不清楚的全部是按原来配方配制的上样Buffer；右边是按照宝生物书上的配方配制的新上样Buffer，菌体破碎得还可以，蛋白质的溶解性也有所增加，但“鬼带”加“纹理”，还是上不了文章。请各位帮帮忙吧！

附件

2014-1-7 17:13

93668239.jpg (39.41 KB)

nn255[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感觉你的电泳体系很不对劲啊。中间那条是marker吗？怎么只有三条带。
目标蛋白是最上面那条？
把胶的浓度变一变，电泳时间加长一点，等溴酚蓝前沿跑出胶版再拆板。
加个电泳胶的配方：

附件

2014-1-7 17:16

73183916.snap.jpg (99.53 KB)

nn255[使用道具]
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发表于 2014-1-7 17:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再看看正常的电泳图，可溶表达，从左到右前三个依次为诱导后全菌，超声破菌沉淀，超声破菌上清
此为12%的SDS-PAGE，还原性电泳，蛋白marker分子量从上到下为97、66、43、31、20KD
我的胶上样量都比较大，目的是为了看看纯化过程中杂蛋白的量，你要发文章，上样量要减小。
在做电泳照片时，请将上样孔保留，是个有用的信息。

附件

2014-1-7 17:17

24989704.jpg (28.4 KB)

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