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标题:【求助】蛋白沉淀的原因！

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发表于 2014-1-8 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白沉淀的原因！

我请问问各位老师同学，引起蛋白沉淀的原因除了PH值，盐浓度，还有哪些原因啊，大家都来讨论讨论吧。另外盐浓度低到什么程度才算低啊，应该是不同的蛋白在相同的盐浓度下溶解度也会不一样的吧。
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发表于 2014-1-8 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 2541 于 2014-1-8 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我请问问各位老师同学，引起蛋白沉淀的原因除了PH值，盐浓度，还有哪些原因啊，大家都来讨论讨论吧。另外盐浓度低到什么程度才算低啊，应该是不同的蛋白在相同的盐浓度下溶解度也会不一样的吧。 ...

我想可能有以下几个因素：
1、蛋白自身的性质
这大概是最主要的原因。例如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易发生疏水聚合而沉淀。这从我们做膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有切身体会。
2、pH值
蛋白质大多数都在高pH时溶解性高，低pH时易沉淀。这可能与氢键的形成有关。但有时候更低pH时蛋白又溶解了。例如，一个蛋白在pH9时可溶，pH6时沉淀，但pH3时又可溶。这种pH沉淀有时候是可逆的，但有时候是不可逆的。特别是蛋白质自身疏水性较强时可逆性较差。例子有我们将包涵体蛋白复性（去除了变性剂）后，如果降低pH，蛋白质沉淀出来，再提高pH往往难以使蛋白再溶，需要加变性剂溶。
3、盐浓度
就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。
4、有机溶剂
例子有丙酮沉淀。但有机溶剂也不是全部对蛋白起沉淀作用，有时候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有机溶剂抽提。
5、温度
高温或低温都有可能使得蛋白质沉淀。煮沸沉淀常见了，低温沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。
6、表面活性剂
对蛋白质有助溶作用。例如做电泳的SDS就是很强的表面活性剂。还有TWEEN，Triton等等。
7、还原剂
还原剂往往对蛋白质有助溶作用。有些蛋白当加入的还原剂在空气中慢慢氧化后，就会沉淀析出。
8、变性剂
如尿素、盐酸胍。包涵体蛋白在用变性剂溶解后，再去除变性剂经常会沉淀析出。
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发表于 2014-1-8 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

including heat, pressure, pH, agitation, freeze-thawing, dehydration, heavy metals, phenolic compounds, and denaturants
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发表于 2014-1-8 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可我的蛋白沉淀是丝状的，刚从柱上下来不到十分钟稍微一晃对着光看就能看见，放一脱盐就更明显了。PH值，温度，水的质量，重金属，有机溶剂，变性剂都排除了。关键是之前也做过这个蛋白，没出现过这种情况，哪位高手知道还有原因我没排除啊。
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发表于 2014-1-8 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种丝絮状的蛋白沉淀我也遇到过两次，都是Ni柱纯化洗脱时发生的。做这两种蛋白，每次都有这个现象，不过不严重，很轻微，过滤掉就算了，不再出现，蛋白损失也很小。没有去深究过。
我猜想这可能有两个因素的作用。一是目标蛋白的性质；另外一个就是收集用的瓶子。注意一点观察，这个丝状沉淀是在溶液表面形成的，像一层很薄很薄的膜。晃动瓶子，就形成丝状了。我猜测当洗脱蛋白进入收集瓶时，干燥的瓶表面和空气的作用，使得蛋白聚集成膜了，进而成丝。
可能的解决办法是先在收集瓶中加入少量的缓冲液，将瓶子润湿。在收集蛋白峰时将收集管插入到收集瓶的液面下。
这个办法我没有验证过，空想而已。下次我做这个蛋白纯化的时候，就来试一试看看有没有效果。到时候再告诉大家结果。
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发表于 2014-1-8 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2014-1-8 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我想可能有以下几个因素：
1、蛋白自身的性质
这大概是最主要的原因。例如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易发生疏水聚合而沉淀。这从我们做膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有切身体会。
2、pH值
蛋白质大多数都在高 ...

对一种符合你所列举的因素2，3和8（PH调到6左右就沉淀，较低浓度盐就会沉淀，沉淀非用高浓度变性剂无法复溶）的蛋白的纯化，你有没有什么建议？
还有对过柱活性弥散的蛋白的纯化（即许多柱许多PH（PB7.4，8.0；TB8.0，9.0）不同盐浓度的洗脱液中都有活性），你是否能提供些建议？
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发表于 2014-1-8 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用什么方式纯化的样品从柱子上下来蛋白就出现了絮状沉淀显现？
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发表于 2014-1-8 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对一种符合你所列举的因素2，3和8（PH调到6左右就沉淀，较低浓度盐就会沉淀，沉淀非用高浓度变性剂无法复溶）的蛋白的纯化，你有没有什么建议？
还有对过柱活性弥散的蛋白的纯化（即许多柱许多PH（PB7.4，8.0；TB8.0，9.0）不同盐浓度的洗脱液中都有活性），你是否能提供些建议？

=================================================================================================

没有什么建议，或避免沉淀的产生，或利用沉淀来进行纯化。
所谓活性弥散其实是蛋白质本身电荷或结构不均匀的表现。根据你试验的结果，要么牺牲纯度取活性收率，要么牺牲活性收率取纯度。
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发表于 2014-1-8 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 greenbee 于 2014-1-8 16:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用什么方式纯化的样品从柱子上下来蛋白就出现了絮状沉淀显现？

我用的是弱阳离子交换柱（CM）十分钟后对着灯管就能发现了，是丝状的！！有的有几毫米长。
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