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标题:【求助】用氯化钙制备DH5a感受态

qumm1985[使用道具]
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【求助】用氯化钙制备DH5a感受态


这一时段时间我一直在做DH5a的感受态用于转化,可就是转化不出菌来,都是按步骤来的呀,为什么呢?细菌本身的问题,还是细节中有绝技。
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is2011[使用道具]
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氯化钙法做出来的感受态细菌,感受效率很低,就是因为它简单省钱,所以被很多实验室奉为独尊,其实它的低感受效率往往导致转化连接产物常常失败,浪费很多时间。
用 inoue 法制备感受态吧。
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qumm1985[使用道具]
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转化率低,但我的是就没长出来过,不应该的吧,再说换方法的可能性不大。
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gmjghh[使用道具]
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氯化钙法转化效率很低,但是完全长不出来就必须分析感受态和质粒的质量了。
1、如果用空载体去转化,仍然没有长出来,但肯定就是感受态或者转化方法的问题;
2、如果用的是连接有目的片段的载体,建议用空载体再试一次,排除载体质粒的影响,因为连接效率对转化效率也有很大影响,只有一步一步排除才能找出原因。
3、另外,可能还有一个原因就是培养基中抗生素的浓度问题,确定没有用错抗生素和搞错抗生素浓度,不同的质粒抗性不一样。
祝好运!
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qumm1985[使用道具]
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1、用空载体做一阳性对照,好谢了。
2、另一问题:由于实验室设备简陋,没有恒温振荡培养器,所以DH5a是静止培养的,有时的手动摇摇,这样培养的细菌能用于制备感受态吗?
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summerxx[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2014-1-8 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、用空载体做一阳性对照,好谢了。
2、另一问题:由于实验室设备简陋,没有恒温振荡培养器,所以DH5a是静止培养的,有时的手动摇摇,这样培养的细菌能用于制备感受态吗? ...

还是第一次见静止培养啊。制备前的细菌状态对转化效率应该是比较重要的。当然我没有试过OD值特别大的情况下来做感受态。你先用空载体转一下试试吧。
ps:附近有没有别的实验室有摇床,若有的话,拿到别人那里去摇嘛。
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966735obeng[使用道具]
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哈哈哈!终于看见有一个和我基本相同遭遇的同仁了,我也是没有恒温培养箱的,也作过和你类似的事情。建议:
1、感受太的效率最好还是确定一下,也就是用空载体做个阳性对照,效率不一定不好的。我觉得一般的转化CaCl2也不错啊,很多实验室都用不仅就是因为省钱了,毕竟也是比较实用快捷的方法。
2、这个是个人想法不知道对吗,没有做更多实验区证实过。我个人感觉可能在你所谓的静态培养的条件下载体的抗性基因没有能按预计的时间表达出来,所以显示不出来的抗生素的抗性,也就没有阳性转化菌了。我曾经做过1小时内的涂板基本不长菌,可是过夜的菌液却可以得到较多的菌落。我个人感觉是正如原核表达目的蛋白一样,诱导表达时候最好到一定OD,也就是细菌有一定数量,同时也有较好生长状态的时候,如此才能得到好的诱导结果;同样,感受态复苏需要时间,静止时容易下沉,同时生长也不会那么好,是否影响了抗性表达?我不确定,你可以试一下,顺便告诉我结果。
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qumm1985[使用道具]
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谢谢,谢谢各位!你说的第二个问题我也想过,不过没敢过夜来恢复抗性。我会试试的。
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qumm1985[使用道具]
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加长复苏时间还是没成功!
我用2.5微升的质粒(滤纸上剪下的,50微升TE浸润,离心,4度保存)转化50微升感受态,(每一毫升OD600=0.42的DH5a菌液用100mmol的氯化钙制成200微升感受态)用50微克/毫升Amp筛选,可做了几次都不成功
1是否是细菌数与质粒的比例错了。
2纸上的质粒邮来后,我在常温放了一段,后又放4度,这样有问题吗?
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JK.jon[使用道具]
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建议你在转接后只摇2个小时,做出来的效果就很好!
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