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标题:【求助】配胶问题?

PCR[使用道具]
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【求助】配胶问题?

我的蛋白大约22kd,要跑SDS-PAGE的胶应该怎么配比较好啊?请前辈们给点建议?
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ero11[使用道具]
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5%浓缩胶,10%分离胶
10% SDS-PAGE蛋白电泳
1.配制分离胶(12%,10ml):蒸馏水4ml;30%丙烯酰胺3.3ml;1.5mol/L Tris(pH8.8)溶液2.5ml;10%SDS 100μl;10%过硫酸铵100μl;TEMED 4μl。
2.灌制分离胶,并用少量的乙醇液封。
3.待分离胶凝后(约25min)配制浓缩胶:(5%,5ml):蒸馏水3.4ml;30%丙烯酰胺830μl;1.0mol/L Tris(pH6.8)溶液630μl;10%SDS 50μl;10%过硫酸铵50μl;TEMED 5μl。
4.除去乙醇后,灌制浓缩胶并插入样品梳。
5.待胶凝后,拔出样品梳,在电泳槽中加入1×Tris-Gly电泳缓冲液,用移液枪吸取样品至加样孔。
6.以恒压60V电泳,至溴酚兰到达浓缩胶底部。
7.以恒压120V电泳,至溴酚兰到达分离胶底部。
8.剥胶,用考马斯亮蓝R250染色数小时,脱色。
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12xunmei[使用道具]
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10%的胶不保险啊,一不小心就跑出去了。最好12-15%的。
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7437654[使用道具]
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10%的分离胶不行的。22kd的蛋白用15%的胶比较好。
queenxxh战友提供的电压条件比较低,我们一般使用120V浓缩胶压缩样品,160-200V电压分离胶分离,用的是biorad的电泳仪,电泳过程大约1hr完成。
考马斯亮蓝R250染色也不需要数小时,新的染液大约20-30min,旧的染液大约40-50min,染的时间长了往往会使得背景很深。
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okhaha[使用道具]
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13.5%分离胶,浓缩胶90v,分离胶120v,大概一小时四十分钟跑完。效果最好!
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PCR[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 7437654 于 2014-1-8 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

10%的分离胶不行的。22kd的蛋白用15%的胶比较好。
queenxxh战友提供的电压条件比较低,我们一般使用120V浓缩胶压缩样品,160-200V电压分离胶分离,用的是biorad的电泳仪,电泳过程大约1hr完成。
考马斯亮蓝R250染色也不需要 ...

我之前试过10%的,不知是电压不够还是怎么了,怎么跑不动啊。
那15%的胶有配方吗?
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QUOTE:
原帖由 okhaha 于 2014-1-8 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

13.5%分离胶,浓缩胶90v,分离胶120v,大概一小时四十分钟跑完。效果最好!

不知13.5%分离胶的怎么配啊?浓缩胶要不要考虑因素?
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我还想问一下。很多配方里面还是有很多小的差异,比如有的用30%的单体贮液,有的用40%的,还有就是同样浓度的分离胶中,10%的SDS和TEMED的量用的也有所不同,请问这个对电泳结果有影响吗?
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ztonyc[使用道具]
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我之前试过10%的,不知是电压不够还是怎么了,怎么跑不动啊。
那15%的胶有配方吗?

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电泳跑不动与胶的浓度关系不大,应该和样品制备、电泳缓冲液、做胶的缓冲液pH有关,仔细检查一下。15%SDS-PAGE配方如下
15%  水  1.1  1.61  2.3  3.22
  30%丙烯酰胺  2.5  3.50  5.0  7.0
  1.5M Tris(pH8.8)  1.3  1.75  2.5  3.50
  10%SDS(μl)  50  70  100  140
  10%AP(μl)  50  70  100  140
  TEMED(μl)  2  3  4  6
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ztonyc[使用道具]
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我还想问一下。很多配方里面还是有很多小的差异,比如有的用30%的单体贮液,有的用40%的,还有就是同样浓度的分离胶中,10%的SDS和TEMED的量用的也有所不同,请问这个对电泳结果有影响吗?

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单体储液的浓度也关系不大,只有计算的配胶浓度准确就行,它们之间的体积差异在配方中用水来调节的。
10%的SDS应该相同,TEMED有所不同很正常。TEMED是催化剂,一般夏天用少一点,冬天用多一点。
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