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标题:【求助】蛋白加热与不加热到底哪个正确

ending[使用道具]
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发表于 2014-1-8 21:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白加热与不加热到底哪个正确


我做了蛋白样品的加热与不加热的对比实验。发现加热过的样品，在50-100kd这个区间内，都没明显的斑点。小于50kd的有些斑点。未加热的样品则正好相反。按照理论解释我怎么也想不清楚。各位赐教
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发表于 2014-1-8 21:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况我也是在做电泳时发现的，同一个蛋白质在做SDS-PAGE时，样品加热和不加热目的蛋白条带的位置是不一样的，而且差距较大，未加热的蛋白条带位置偏上。蛋白质在凝胶中的迁移率和其电荷、尺寸和形状有关，上样缓冲液中的SDS将蛋白质表面所带的电荷中和，排除了电荷的影响，巯基乙醇能够将蛋白质的二硫键打开，但是维持蛋白质高级结构的还有一些非共价键，不加热并不能使蛋白质完全变性而变成单链。也就是说未加热的蛋白质还可能存在高级结构，使蛋白质保持一定的空间构相和形状，从而影响的它的迁移率。个人自己理解的，呵呵，不知道对不对，还是请高人指教。
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发表于 2014-1-8 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如楼上所说，sds清除了电荷的影响，剩下的就和结构有关了。我想，无论加热和未加热，样品的目的蛋白的分子量肯定是不变的。如果加热的与未加热的位置都不一样，那测出来的分子量岂不不一样了，那这对我们的后续工作肯定会带来很重要的影响，弄不好就要走错路啊。换句话说，你认为未加热的位置偏高，可是样品中有很多蛋白，谁能保证偏高的比较明显的就是目的蛋白呢？就差几个氨基酸的蛋白有的是，位置稍微偏一点甚至重合都很可能。而卧做的对比实验发现，（保证是在相同条件下的对比实验，除了加热与否），样品的目的条带在加热后感觉是很淡或是可以说没有。这就更难以解释了。所以我认为，western blotting对于蛋白研究虽然很普遍，但不是什么好办法。蛋白的定性定量应该去用其他的方法。可惜啊，别的方法俺还一点不会，惭愧。请高人指教
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birdfish[使用道具]
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发表于 2014-1-8 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remonte 于 2014-1-8 21:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种情况我也是在做电泳时发现的，同一个蛋白质在做SDS-PAGE时，样品加热和不加热目的蛋白条带的位置是不一样的，而且差距较大，未加热的蛋白条带位置偏上。蛋白质在凝胶中的迁移率和其电荷、尺寸和形状有关，上样缓冲液中的S ...


这位战友说得很好、很明白，赞同！
有的蛋白质在做SDS-PAGE时，即使上样buffer中含有高浓度的DTT，也充分加热变性了，可能还是有聚集体不能完全打开。实际的例子有HBV的表面抗原，无论怎么处理样品，大分子的聚体或多或少总是有。其它的一些蛋白，如大肠杆菌生产的伽马干扰素也有SDS-PAGE中的二聚体、三聚体存在。这都是我在实际工作中碰到过的实例。所以在蛋白质的空间结构中，二硫键、氢键、离子键、疏水力、修饰作用（糖基化，脂肪含量）等等都对SDS-PAGE有影响。
SDS-PAGE有它的局限性，但不失为蛋白质检测的方便有力的工具。只是我们在对试验结果进行分析时，要知道SDS-PAGE有可能不会完全打开蛋白质的空间结构。
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发表于 2014-1-8 21:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ending 于 2014-1-8 21:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如楼上所说，sds清除了电荷的影响，剩下的就和结构有关了。我想，无论加热和未加热，样品的目的蛋白的分子量肯定是不变的。如果加热的与未加热的位置都不一样，那测出来的分子量岂不不一样了，那这对我们的后续工作肯定会带来很 ...

是啊，SDS-PAGE和WB都只是对蛋白质进行定性检测的一个有局限的工具。所以，如果要检测的蛋白很重要，如药用重组蛋白的生产，往往要使用多种检测手段去互相验证。这里面包括但不局限于，HPLC，活性检测，还原型和非还原型SDS-PAGE，WB，Elisa、质谱、肽图、N端、C端氨基酸序列、氨基酸组成分析、等电聚焦等等各种检测手段。
总而言之，没有一种方法是万能的，只是互相验证支持。看你对试验要求的程度，对时间、技术、设备和费用、人员素质，来选择一种或几种检测方法来验证。
“样品的目的条带在加热后感觉是很淡或是可以说没有”，加热以后，有些蛋白质斑点分离开来了，相应的量也减少了，所以斑点强度变弱是可以理解的。打个比方，100kd的蛋白斑点量为100ng，分成40kd和60kd的两个点，蛋白斑点量只是40ng和60ng了，显色强度自然减小。你未加热的样品本来就不是很强，分开后就更不强了。
一些个人的快速闪念，大家来讨论吧。
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发表于 2014-1-8 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗨，是聚体没有打开。
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发表于 2014-1-8 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你的蛋白多大，带的位置在哪？考虑下聚体的问题，是不是整数倍？
加热确实有利于打开聚体，做好的样品放置时间长短也有一些影响，巯基乙醇的作用跟时间有关系。
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发表于 2014-1-8 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. wb只是个定性方法，而且还不是很准确。可为什么一些sci文章里也只是用wb的结果就定结论这个点就是目的蛋白呢？国内的文章就不说了。这岂不是很不严谨。
2. 您说的100kd分为2个点的问题，这都已经是不同的蛋白的问题了。目的蛋白都没了，请问您在工作中又如何保证您的目的蛋白正常显示呢？除了增加上样量以外。
3. 如您说的测蛋白的方法中，比如hplc，ms，活性检测等，有没有相关的内容给我们这些后来人推荐一下，也让我们少走弯路啊。
谢谢
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-1-8 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. wb只是个定性方法，而且还不是很准确。可为什么一些sci文章里也只是用wb的结果就定结论这个点就是目的蛋白呢？国内的文章就不说了。这岂不是很不严谨。

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我没有在任何地方说WB定性不是很准确啊。WB可以定性，可能现在往定量方向发展，但还不成熟。
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-1-8 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2. 您说的100kd分为2个点的问题，这都已经是不同的蛋白的问题了。目的蛋白都没了，请问您在工作中又如何保证您的目的蛋白正常显示呢？除了增加上样量以外。

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这不是目的蛋白没有了，而是蛋白聚体打开了。
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