【求助】重组蛋白 western-blot后出现很多杂带

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标题:【求助】重组蛋白 western-blot后出现很多杂带

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

重组表达的蛋白（未纯化），做western-blot后出现很多杂带，有点像考染的效果，不知道为什么？同样的抗体用来做纯化的蛋白（商品）则没有这个现象。求高手指点迷津

131415[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的抗体加的比例是不是一致的，两个蛋白是在一张上面做的吗，若不是，可能存在染色时间长了；如果你的重组蛋白未纯化的条带较目的带小，可能会是降解。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 131415 于 2014-1-9 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的抗体加的比例是不是一致的，两个蛋白是在一张上面做的吗，若不是，可能存在染色时间长了；如果你的重组蛋白未纯化的条带较目的带小，可能会是降解。 ...

抗体比例是一样的；对照是放在一起做的；不是很明白你说的染色时间长了是指抗体孵育时间还是显色时间？如果是显色的话应该不会，都很快终止的；至于抗体孵育时间，我都是一抗四度过夜，二抗３７度一个小时。蛋白降解也许会有，但应该不会那么严重，看起来就像考染那样，所有带都出来的样子。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢131415的分析，或许我可以考虑下孵育的时间～　　希望大家再给我提提建议～

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人感觉可能有以下原因：
1.抗体大半用兔来制备，兔可能感染过大肠杆菌，此大肠杆菌与表达宿主菌有许多共同抗原。
2.WB是很敏感的，比考染敏感超过一个数量级，蛋白在迁移过程中可能会有一部分表达的目的蛋白迁移到其它区域，虽然很少，但因为WB的敏感还是会显色的。
3.显色方法的原因，转印膜上的结合有不同质的蛋白，所以染料会有不同的结合色差，特别是膜要干没干的时候最明显，
解决办法：
1.高免血清最WB前，用未诱导的宿主菌吸附一下
2.减少一抗或二抗的浓度。
3.选择合适的显色方法，

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢上面几位战友的指点！　我的一抗和二抗都是２０００倍稀释，貌似已经比较低了，不知再稀释还可以不可以？xuezhishui　的建议会采纳　谢谢：）　
说到的解决办法１　我不是很懂～　呵呵　希望有更直白的讲解

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对了，补充一点，我的封闭液是２％ＢＳＡ，是不是改用脱脂奶粉更好？因实验室没买脱脂奶粉，而其他人用２％ＢＳＡ做并无问题，所以也就这么用。

6327555[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我可以明确的告诉你，如果样本是从e.coli分离得来的，没有经过纯化，用WB是不适合的。
原因如下：我们用的抗体一般都是从原核表达的蛋白作为抗原，免疫动物后得到抗体。需要牢记在心的是，作为抗原注射到身体里的除了重组蛋白，还有少量细菌的蛋白，这些细菌蛋白引起的免疫反应比重组蛋白引起的免疫反应要高。所以如果有少量的细菌蛋白存在的话，你的重组蛋白在WB中很弱了。如果一定要用WB的办法看，纯化是必需的，即使做了纯化，你的条带和非特异的条带比，也是很弱的。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家，基本上问题就是楼上两位战友提到的原因吧，我打算纯化后再做就知道是不是了。不过其实目的带还是很强的，比其它条带强。