【求助】植物叶片全蛋白2D电泳求教

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标题:【求助】植物叶片全蛋白2D电泳求教

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发表于 2014-1-9 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做2D已经有段日子了，可是感觉还是有很多问题，恳请各位高手指点交流。
我的材料是植物叶片，用的是TCA-丙酮沉淀提取，然后用裂解液溶解后离心上样。这里边的离心一般应该采用多少G？我使用的是15000rpm可以吗？之后我用的是pH 4-7 ，13cm 胶条。
IEF程序： 30 V 12Hr， 100 V 1Hr，200 V 1Hr， 500 V 1Hr， 1000 V 1Hr ，8000V grad 1Hr，8000V 聚焦64000Vhr。之前做的总有明显的横向拖尾，因此我增加了聚焦。
接下来，胶条平衡，SDS-PAGE ，采用银染。
附图如下：

附件

2014-1-9 10:55

17357131.snap.jpg (42.08 KB)

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发表于 2014-1-9 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上端是前沿，左边为正极。
顶部的那条横纹很明显，做了几次总是有，不知道怎么样才能解决。
底部大分子区域，横向拖尾也很严重，我增加聚焦后，有一定的改善，但是还是不理想。
我之前用pH 3-10 的做过，感觉高pH 端蛋白点很少，所以才更换用4-7 。然而，做下来感觉点很少，貌似没有完全分开，是要进一步增加聚焦么？稍后我发以前的pH 3-10的图。
大家帮我看看，指点下阿！先谢过了~

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发表于 2014-1-9 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

之前pH 3-10 的图，也做的不好，大家多指教指教...

附件

2014-1-9 10:56

29282277.jpg (16.08 KB)

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发表于 2014-1-9 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我以前也做过植物各个部位的蛋白提取，感觉叶片里的蛋白还是很多的，但是植物细胞里面的色素比较多，所以提取出的蛋白样品一般颜色较深。我推荐一个protocol，祝你成功
1、液氮研磨样本，充分破碎组织。叶片是很好磨的部分，一定要研成粉。
2、预冷的 TCA/丙酮/65mM DTT 沉淀，-20度，一小时，离心，去上清，风干。预冷丙酮沉淀，-20度，1小时。离心，去上清，风干。
3、裂解。1.5ml EP管中放入100-200ul样品，加入1ml裂解液，超声破碎
4、离心，收上清。这里样品中有很多颗粒，所以转速一定要高
5、0.22um滤膜过滤，如果你上一步做的好，这一步是很轻松就能过的
6、超滤浓缩样品（建议用超滤管超滤），备用

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-1-9 10:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上了多大量啊！感觉点不是很多，如果浓度还可以的话，稍微纯化一哈，尝试一哈！纯化后加大上样量，用4-7的胶条跑一个看看！
选个试剂盒纯化就挺好用的！

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发表于 2014-1-9 10:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

叶片的蛋白提取，色素确实很多，我得到的蛋白沉淀也都带有淡淡的颜色，有裂解液裂解后，15mg/300ul 裂解液。我的提取蛋白程序和你的差不多，我TCA-丙酮溶液加入的是巯基乙醇。之后用丙酮洗涤沉淀2次，15000rpm 离心后，风干。
裂解的时候我没有用超声，因为我实验室没有适合的超声仪。我就是混匀后放置在4 度3Hr。
我每步离心都是15000rpm，是要再提高吗？
我也看到很多的地方说要超滤浓缩，但是我不晓得具体怎么操作..（比较菜），能给我具体说说吗？

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发表于 2014-1-9 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我4-7的那个胶上样量250ug。
现在我也觉得样品的制备可能存在很多问题..
像很多帖子里说的要除盐，除脂除核酸的..我就像上面说的，没有再进一步纯化过。
请教下，都有哪些好的纯化的方法么...买试剂盒..clean up kit 考虑过，但是太贵了，买不起啊...

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发表于 2014-1-9 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我正计划着重新制备一次蛋白样品：
叶片液氮研磨后加入预冷的10%TCA、0.07%巯基乙醇的丙酮溶液中，4度放置1Hr，20000g离心30min，沉淀用含0.07%巯基乙醇的丙酮重悬，4度过夜。20000g离心30min后，用90%丙酮洗涤沉淀2次，风干。再用裂解液溶解，放置3Hr，20000g离心30min，取上清液上样。
大家分析一下，这样行不？还需要什么别的处理过程？我看到很多帖子说超滤浓缩，我做的是植物叶全蛋白，超滤管应该如何选取呢？裂解时，蛋白确实很难溶解，有什么好的方法没？请多多指教~谢了

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发表于 2014-1-9 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

叶片液氮研磨后加入预冷的10%TCA、0.07%巯基乙醇的丙酮溶液中，4度放置1Hr，
这一步过夜是不是更好一些呢？？？
tca--丙酮是起沉淀作用的，丙酮只是洗的吧？？？

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发表于 2014-1-9 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我又重新提了一次蛋白，并且继续增加了聚焦时间做了一次。不知道什么原因，第一项IEF电压没有上升到8000V，第二项跑完染色后，图特别的糟糕，在高分子量区域黑成一片。难道是我蛋白提取又出现问题了？离子浓度太大？真是郁闷至极...图就不发了..
休整一下，明天继续...

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