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标题:【求助】GST融合蛋白诱导

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】GST融合蛋白诱导

大家好。最近我做GST融合蛋白，做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序，测序结果没有问题，也已经融合上。 可是，30度，用IPTG1mM诱导4小时，从SDS-PAGE结果看，只发现对照组有GST蛋白表达，重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下！！
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u234[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不表达原因挺复杂的，我们实验室貌似经常会遇到这种事。
检查一下质粒启动子、ATG等有没有问题，要不换个载体，换个菌株。祝好运！
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是空载体转化的有GST表达呀
所以我觉得启动子没问题吧
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u234[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

空载序列没问题，难道敢保证重组质粒序列就没问题？
因为没表达，无非就是要确保重组质粒、表达菌株、诱导条件。空载都能表达，意味着诱导条件，菌株是没问题的啊！
PS：多想想，多排除，我们实验室出现不表达的情况，我们实验员把质粒序列都检查过了，没问题，就是不表达，有时是无法解释的，但同学换个载体就行了。
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jrwyyplt[使用道具]
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 小中大
我看看吧。现在我用的是PGEX-4T-2，菌株是BL21。现在我同学用相同的质粒和菌株表达出了GST融合蛋白，而且量相当大。你能否推荐几个合适的载体呀？？有些啰唆，见谅见谅呀，试验在此停滞不前，急呀
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发表于 2014-1-9 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其他的表达系统最常见的就是 pQE 系列 和 pET 系列。
实验室有的话就试试看，没有的话找别人要一点，或者换蛋白质。
Are you sure the plasmid DNA sequence is OK?
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测序结果是正确的 没有问题呀
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H2O[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

连WB都测不到啊？你有没有看你的序列里是不是有很多稀有密码子啊？特别是ATG后面25个氨基酸。
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不妨换一下表达菌种，推荐用Rosetta (DE3)试试，它可以有效表达一些稀有密码子！我今年刚毕业的一个师姐就遇到这样的问题，她也是做GST融合表达的，先前在BL21怎么都表达不出来，换成Rosetta 就表达了！
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-1-9 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢了呀 我试验试验下
那个稀有密码子多少是多呀
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