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标题:【求助】2-D求助，大家帮我分析一下原因吧！

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发表于 2014-1-9 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】2-D求助，大家帮我分析一下原因吧！


我最近在做燕窝双向电泳，图谱放在word里面了，丙酮沉淀、TCA-丙酮沉淀还有酚抽提的方法都试验过了，2-D图谱还是没有改善，酸端大量横竖条纹，蛋白质点少，等电聚焦电压上不去，估计是盐分太多或者是糖蛋白，大家帮我提一些意见，先谢谢了！
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发表于 2014-1-9 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

超声破碎（去离子水），丙酮沉淀，丙酮洗涤，冷冻干燥，裂解液（8M尿素，4％CHAPS，100Mm DTT, 0.5% CA），上样蛋白：850ug，等电聚焦电压达到3100V，总为11000Vh
pH3-5.6胶条，7cm，银染
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发表于 2014-1-9 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白沉淀方法的比较：
样品1：丙酮沉淀，丙酮洗涤
样品2：TCA-丙酮沉淀，丙酮洗涤
样品3：酚抽提，甲醇、丙酮洗涤
样品4：TCA-丙酮沉淀蛋白干粉，溶解后酚抽提，甲醇、丙酮洗涤
样品5：丙酮沉淀干粉裂解液溶解后，超滤浓缩管除盐
样品6：TCA-丙酮沉淀干粉裂解液溶解后，超滤浓缩管除盐
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发表于 2014-1-9 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

离心管超滤除盐，GE公司clean-up试剂盒也用了，等电聚焦的时候设置的电压还是上不去，特别是clean-up试剂盒纯化样品后蛋白浓度降低了好多，大概有接近10倍。现在是一筹莫展！
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发表于 2014-1-9 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解液中没有硫脲，会不会有影响呢？（硫脲的作用是辅助尿素的溶解）
比较奇怪的就是用了clean-up试剂，聚焦还是上不去，难道是一向电泳仪有问题？？
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发表于 2014-1-9 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳仪应该没有问题的，因为其他同学也在跑双向，一切正常。酚抽提蛋白后裂解液中含有2M 硫脲，忘记改过来了。
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发表于 2014-1-9 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想知道酸端黑乎乎那些东西是盐分、糖蛋白还是其它？着急！
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发表于 2014-1-9 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

850微克，可以考染了。而且是7cm的胶条。胶条越短上样量应该越少的。
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veiwu[使用道具]
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 小中大
后面上样量都降到20ug了，还是有那么多黑乎乎的东西！
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发表于 2014-1-9 11:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白点少会不会是蛋白定量不准确,上样量低的原因呀?
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